[发明专利]一种微孔阵列芯片的数字PCR实时分析方法

说明书

本发明提供了一种微孔阵列芯片的数字PCR实时分析方法，具体包括如下步骤：S1:微孔的倾斜矫正；S2:图片的偏移矫正；S3:提取荧光值；S4:基于随机森林计算预测CT值。本发明基于扩增过程中的荧光值的变化计算反应单元的CT值，分析反应单元的扩增不均一问题、分析反应单元的阴性阳性问题、依据CT值分析通道串扰等问题。在数字PCR分析领域具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微孔阵列芯片的数字PCR实时分析方法。

背景技术

PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)是一种体外核酸扩增系统，基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。该技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经「高温变性—低温退火—引物延伸」三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

qPCR(实时荧光定量聚合酶链式反应)是指在PCR进行的同时，对其过程进行监测的能力(即实时)。将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。Ct值是每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。

dPCR(数字PCR)基于聚合酶链式反应的原理精确的测定基因拷贝数，实现对基因突变定性和定量分析。微孔阵列芯片数字PCR是将DNA或RNA样本稀释并分散成数万甚至数百万个独立的反应单元，每个反应单元中包含(或不包含)1个或1个以上目标分子(DNA或RNA 模板)。微反应单元单层平铺于芯片内，将芯片放入升降温装置，针对所有的微反应单元的靶序列进行分子模板PCR扩增，扩增过程中微反应单元的荧光强度不断增强，完成扩增后。 CCD或者CMOS相机在光学成像系统中采集用于特定基因片段标记的荧光探针信号，依据荧光信号强弱判断微反应单元的阳性或阴性，最终基于统计学分析(泊松分布)检测样本中核苷酸的浓度。数字PCR不依赖扩增曲线的循环阈值，不受扩增效率的影响，能够直接读出DNA分子的个数，是一种核酸分子绝对定量技术。

dPCR(数字PCR)是在反应单元完成扩增后，基于CCD相机在光学成像系统中采集荧光信号，依据荧光信号强弱判断微反应单元的阳性或阴性，此方法无法实时观测扩增过程中每一个反应单元的荧光值的变化。反应单元样品的测定在各种条件上不会完全一致，会造成 PCR扩增效率的差异。扩增过程中荧光值变化数据提供了反应单元的扩增不均一的信息，改进实验的条件。判断反应孔的阴性和阳性时，不仅依据荧光值的强弱，而且依据不同循环荧光值变化，增加了反应孔的阴性和阳性判断的准确性，减少了阳性反应孔的误判。依据反应孔在扩增过程中的荧光变化值计算反应孔的CT值，通过CT值设置判断受串扰影响的反应单元。

发明内容

本发明基于扩增过程中的荧光值的变化计算反应单元的CT值，分析反应单元的扩增不均一问题、分析反应单元的阴性阳性问题、依据CT值分析通道串扰等问题。

本发明的目的在于：

1)微孔阵列式芯片数字PCR的成像系统中，每拍摄一张芯片，滤光片、相机、芯片载台都会发生位置的相对移动，导致不同循环次数拍摄的图片发生相对的倾斜或者位置偏移。针对上述情况，本专利基于每一图片的反应孔的位置信息生成横向连接的像素带分布图像，如图2。依据横向灰度投影值选择最佳矫正角度。