[发明专利]基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒

权利要求书

1.一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，其特征在于，包括以下组分：

(1)样本稀释液；

(2)NanoLuc荧光素酶和梅毒螺旋体黏附素蛋白TP0136抗原组成的融合蛋白液；

(3)proteinA/G包被的酶标板；

(4)洗涤液；

(5)荧光素酶底物。

2.根据权利要求1所述的一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液为2％脱脂牛奶。

3.根据权利要求1所述的一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，其特征在于，所述融合蛋白液通过以下方法制备而成：

a、以TP0136抗原基因序列为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经凝胶电泳及核酸纯化获得TP0136抗原基因片段；

b、将获得的TP0136抗原基因片段与NanoLuc荧光素酶基因的pNLF1载体质粒分别进行Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切，并使用T4连接酶将酶切产物连接得到重组质粒；

c、将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，通过菌液PCR筛选转基因阳性菌；

d、在200ml LB液体培养基中扩繁转基因阳性菌，并用质粒提取试剂盒提取重组质粒；

e、通过琼脂糖凝胶电泳验证步骤d提取重组质粒的质量，通过紫外分光光度计检测提取重组质粒的纯度和浓度；

f、在10cm²细胞培养皿中培养He La细胞，当细胞铺板率达到80～90％时，以脂质体核酸转染试剂：步骤d所得重组质粒按照3μL:1μg的比例进行转染，37℃、5％CO₂培养箱中培养48～72h，弃细胞培养液，并加入5ml 0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液用细胞刮刀将细胞收集至15ml离心管中，最后将细胞收集液在冰浴中超声处理15～30min得细胞裂解液，然后将细胞裂解液于4℃，12000rpm离心15～45min，弃沉淀，收集上清液即为融合蛋白；

g、将上述所得融合蛋白用0.01M、pH7.4的PBS磷酸盐缓冲液稀释得融合蛋白液，要求融合蛋白液每10μL中有10⁷个荧光单位，-20℃保存备用。

4.根据权利要求1所述的一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，其特征在于，步骤a中，PCR扩增的引物为：

上游引物：5'-ATGACGTGCGATTTCACTGG-3'，

下游引物：5'-CTCGCGGTTCCAGGAGCACG-3'。

5.根据权利要求1所述的一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，其特征在于，所述proteinA/G包被的酶标板的制备方法如下：

a、proteinA/G用0.01M、pH7.4 PBS溶解为1μg/mL的浓度；

b、按照100μL/孔将上述proteinA/G溶液加入酶标板中，酶标板覆膜，4℃孵育12～16h；

c、弃proteinA/G溶液，300μL/孔用0.1％PBST洗3次，4℃保存。

6.根据权利要求1所述的一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，其特征在于，所述洗涤液配置方法为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.63g，KH₂PO₄0.24g，加水定容至1L，灭菌。

7.根据权利要求1所述的一种基于TP0136建立的梅毒病期检测免疫共沉淀试剂盒，其特征在于，所述荧光素酶底物为Promega公司的furimazine荧光素酶底物。