[发明专利]一种流式染色试剂盒及其配置方法和应用方法

说明书

本发明公开了一种流式染色试剂盒及其配置方法和应用方法，具体为一种用于检测哺乳动物有核细胞胞浆内各类蛋白分子的流式染色试剂盒配制方法及其应用方法，所述试剂盒包括流式胞内固定/破膜液和流式胞内破膜/洗涤液。本发明的固定/破膜液由多聚甲醛、皂素、磷酸盐缓冲液组成；破膜/洗涤液由皂素、胎牛血清、金属离子螯合剂、磷酸盐缓冲液、防腐剂组成。该试剂盒可联合多种标记了荧光素的抗体共同使用，通过破膜/洗涤液将细胞膜进行打孔，使标记荧光的抗体分子进入细胞浆内与特定抗原蛋白结合。将上述细胞通过流式细胞仪检测，即可获得特定胞浆内蛋白分子表达的信息。本发明可用于多种细胞的流式免疫检测。

技术领域

本发明涉及一种流式分析用细胞内蛋白染色试剂盒及其配置方法和应用方法，属于细胞内蛋白分子检测技术领域。

背景技术

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种可以对处于快速直线流动状态中的单列细胞、微生物或人工合成微球等生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量或分选的技术。流式细胞术可实现高通量检测，每秒钟检测的细胞数目可达数千个，被检测的细胞数最高可达数百万；能对单列细胞或生物颗粒进行逐个检测；通过多参数、多色荧光分析实现对细胞的准确识别和计数，对细胞进行定性、定量，还可根据细胞等生物颗粒的性状对其进行分选。对同一个细胞做有关物理、化学、生物等特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义，流式细胞术已被广泛应用于各个领域之中。

细胞因子(cytokine，CK) 是在免疫系统中有重要功能的一类蛋白质，是指由免疫细胞（如T细胞、B细胞、NK细胞、单核/巨噬细胞等）和某些非免疫细胞（如内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞、骨髓及胸腺基质细胞等）经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质，多属分子量为6~60kDa的多肽或糖蛋白。细胞因子通常包括白细胞介素(interleukin， IL) 、干扰素(interferon，IFN) 、肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor，TNF) 、造血因子、趋化因子、各种细胞生长因子等。细胞因子在体内广泛参与免疫应答及调节、促进组织修复、刺激造血功能、刺激细胞的增殖与分化、参与细胞凋亡等重要生理活动。某些因素可导致一些细胞因子的异常表达或功能异常，从而参与炎症反应、免疫性疾病、肿瘤性疾病等病理过程的发生与发展。细胞因子必须通过与靶细胞膜表面特异性受体（即细胞因子受体， cytokinereceptor， CKR）相结合，才能发挥其广泛的生物学效应。检测活化免疫细胞内的细胞因子，对于研究分泌细胞因子的细胞类型、产量，所分泌细胞因子的种类和评价细胞免疫功能等具有重要价值。

细胞内染色结合流式细胞术分析是确定某些细胞内细胞因子或蛋白表达水平的一种简便快捷的方法。流式细胞术分析细胞内抗原的关键在于要使荧光标记的单克隆抗体能自由进人细胞内，且不能破坏细胞形态的完整性和保持细胞内靶抗原不变。鉴于上述要求，流式细胞术分析细胞内抗原的主要环节在于细胞固定（保持细胞形态的完整性）和在胞膜上打孔穿透（使荧光标记的单克隆抗体能自由进人）。

理想的固定方法应该是使抗原固定，同时保持细胞、亚细胞结构的真实性，使抗体能够充分地与所有细胞、亚细胞结构内的成分接触。但是，目前还没有一种方法能做到这一点。固定方法可分为两大类，第一为沉淀法，其可使细胞蛋白成分沉淀于局部其他亚细胞结构上，通过这种方式固定细胞的固定剂为有机溶剂，如甲醇、乙醇和丙酮等，其能够迅速溶解脂类物质，使细胞脱水，把蛋白质沉淀在细胞结构上，但会导致许多被抗体识别的表位发生改变，由于这类固定剂的溶脂作用，即对细胞已经产生了通透作用，故在随后的步骤中不必再用穿膜剂进行穿膜；第二为交联法，即通过化学键与细胞内其他分子连接，如甲醛、多聚甲醛、戊二醛等，它们一般是通过自由氨基基团把生物分子桥连起来，形成一个相互连接的抗原网，但交联剂没有穿膜作用，故在随后的步骤中需经去污剂溶解脂类成分进行穿膜，从而增强细胞的通透性，其中多聚甲醛具有相对更优的稳定性和安全性，能使抗原固定并且更好地保持细胞、亚细胞结构的真实性，使抗体更充分地与抗原结合，故本试剂盒选用多聚甲醛来固定细胞。