[发明专利]与中华绒螯蟹抗鳗弧菌相关的SNP分子标记、引物对、筛选方法及应用

说明书

本发明属于蟹类分子标记筛选技术领域。针对鳗弧菌感染中华绒螯蟹患病，具体公开了一种与中华绒螯蟹抗鳗弧菌关联的SNP分子标记、引物对、筛选方法及应用，所述分子标记序列如SEQ ID NO:3所示，且其852位碱基处存在一个T或C的等位基因突变。以设计SEQID NO:1所述的正向引物和SEQ ID NO:2所述的反向引物的引物对，以鳗弧菌感染中华绒螯蟹基因组DNA为模板扩增CatB基因；设计如SEQ ID NO:4所述的正向引物和如SEQ ID NO:5所示的反向引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，对目的条带清晰无杂带的PCR产物进行测序筛选得到。本发明中与中华绒螯蟹抗鳗弧菌相关的SNP分子标记有利于推进中华绒螯蟹遗传育种，为中华绒螯蟹的抗菌选育工作提供新思路。

技术领域

本发明属于蟹类分子标记筛选技术领域，涉及一种与中华绒螯蟹抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)关联的单核苷酸多态性(SNP)分子标记，特别涉及一种位于中华绒螯蟹组织蛋白酶B(CatB)基因上与抗鳗弧菌相关的SNP分子标记、引物对、筛选方法及应用。

背景技术

中华绒螯蟹是我国重要的水产养殖品种。近年来，由于细菌、真菌和病毒等原因造成中华绒螯蟹的大量死亡，给蟹养殖业造成了巨大的经济损失。弧菌是中华绒螯蟹大量死亡的主要原因。因此，选择高抗性的中华绒螯蟹是一种有效的育种方案。

传统的选择性育种是根据表型来对个体的育种价值进行估计，耗时长，而且总受环境的影响。标记辅助育种是一种基于基因型使用DNA标记进行选择育种的分子方法，使选择更加高效和经济。由于SNP是生物体中最丰富的多态性，因此在各种DNA标记中，SNP成为分子遗传分析的首选DNA标记。从遗传角度出发，SNP分子标记不仅可以评估中华绒螯蟹遗传多样性，还为中华绒螯蟹的抗鳗弧菌选育工作提供直接的遗传标记，目前还没有与中华绒螯蟹抗鳗弧菌相关SNP位点的相关报道。

发明内容

本发明针对鳗弧菌感染中华绒螯蟹患病，提供一种与中华绒螯蟹抗鳗弧菌相关的SNP分子标记、引物对、筛选方法及应用，该分子标记上的SNP位点位于中华绒螯蟹免疫相关CatB基因上，该分子标记为抗鳗弧菌中华绒螯蟹的选育提供基础。

本发明中，与中华绒螯蟹抗鳗弧菌相关的SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，且其852位碱基处存在一个T或C的等位基因突变。

本发明还提供一种扩增以上所述的与中华绒螯蟹抗鳗弧菌相关的SNP分子标记的引物对，所述引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明还提供了上述与中华绒螯蟹抗鳗弧菌相关的SNP分子标记的筛选方法，包括以下步骤：

(a)用鳗弧菌感染中华绒螯蟹后，提取基因组DNA，以SEQ ID NO:1所述的正向引物和SEQ ID NO:2所述的反向引物的引物对，以蟹基因组DNA为模板，扩增CatB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

(b)设计引物对如SEQ ID NO:4所述的正向引物和如SEQ ID NO:5所示的反向引物，以CatB基因为模板进行PCR扩增反应；

(c)经琼脂糖凝胶检测，对目的条带清晰无杂带的PCR产物进行测序，筛选得到上述SNP分子标记。

优选，步骤(b)中，所述PCR扩增反应体系为：正向引物(10μM)和反向引物(10μM)各1μL、基因组DNA模板1μL，Taq酶0.2μL(1U),10×PCR缓冲液2.5μL，MgCl₂(25mM)2.5μL，dNTP(10μM)2μL和ddH₂O 14.8μL。

优选，步骤(b)中，所述PCR扩增反应的程序依次为：95℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃再延伸10min。