[发明专利]一种不依赖于抗体类型的抗体检测方法及其应用

说明书

本发明属于免疫生物学检测领域，涉及一种不依赖于抗体类型的抗体检测方法及其应用，具体涉及一种免疫血清学病原微生物和自身免疫性疾病总抗体检测及其应用方法。本发明是利用一种能同时识别抗体κ轻链和λ轻链的检测抗体分析病原微生物和自身免疫性疾病特异性总抗体水平。

技术领域

本发明属于免疫生物学检测领域，涉及一种病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体检测诊断及其应用。

背景技术

抗体是免疫系统产生的抵御病毒、细菌等外来物质的免疫球蛋白。脊椎动物体内的抗体是由重链和轻链组成，抗体重链可分为μ、δ、γ、ε和α五种重链亚型，对应的免疫球蛋白名称分别为：免疫球蛋白M(IgM)，免疫球蛋白D(IgD)，免疫球蛋白G(IgG)，免疫球蛋白A(IgA)，免疫球蛋白E(IgE)。抗体轻链可分为κ链和λ链两种亚型。

当病原微生物感染人或其它动物后，被感染人或动物体液中会产生针对病原微生物特异性IgM和/或IgG抗体。初次感染后，IgM型抗体10-14天产生，然后逐渐降低，IgG抗体14-20天产生，然后逐渐降低。再次感染同一种病原体后，IgM持续时间较短，IgG持续时间较长。

病原微生物免疫血清型检测包括抗病原微生物抗原的IgG抗体、IgM抗体和总抗体检测等。其中，IgG抗体检测是用于检测人血清、血浆或全血中的抗病原微生物的IgG抗体。当出现可疑感染时，该检测可用于明确病原微生物感染或被测者的免疫状态。IgM抗体检测可通过捕获法测人血清、血浆或全血中的抗病原微生物的IgM抗体，在微孔中预包被鼠抗人IgM(μ链)抗体，待检标本的IgM抗体都可被捕获，未结合的其他成分(包括特异的IgG抗体)将被洗涤除去。接着，加入辣根过氧化物酶标记的病原微生物抗原，被捕获的抗病原微生物的IgM会与辣根过氧化物酶标记的病原微生物抗原特异性的结合，洗去其他未结合物。最后，用TMB底物显色产生信号，从而判定样品中的抗病原微生物的IgM抗体的存在与否。总抗体检测一般采用双抗原夹心法检测血液样本中的病原微生物总抗体(包括IgM、IgG和IgA等各种抗体类型)。

检测IgM抗体可用于确认近期感染，检测IgG抗体可用于确认是否既往感染过这种病原体。总抗体则包括了IgM和IgG在内的全部特异性抗体。检测总抗体，既包括了IgM抗体检测早期诊断的优势，又有检测IgG抗体既往感染的特点，可以显著提高感染者的发现率，有效防止漏检的发生。

双抗原夹心法检测包括抗病原微生物的IgA、IgG、IgM、IgD和IgE总抗体时存在缺陷。双抗原夹心法需要对抗原进行标记，一些生物大分子如辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)标记会造成抗原位点的屏蔽和破坏，造成检测结果假阴性的产生。有些标记后的抗原稳定性差，容易造成聚集和沉淀，对抗病原微生物的总抗体检测产品的工艺开发产生不利影响。

发明内容

本发明提供了一种检测分析样本中抗病原微生物总抗体的方法。总抗体检测抗体可以识别所有抗体类型(IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)的抗体。该方法通过将N-RBD(SARS-CoV-2NP连接的S-RBD)抗原固定在固相载体上，样本中的抗病原微生物特异性总抗体(IgA、IgG、IgM、IgD和IgE抗体)与抗原结合后，最后加入HRP标记的总抗体检测抗体。与传统的抗病原微生物总抗体检测比较，本发明总抗体检测不涉及抗原的标记，制备的总抗体检测试剂具有稳定性好、灵敏度高等优点。SARS-CoV-2NP连接的S-RBD是一个融合蛋白，它是通过基因重组技术将编码SARS-CoV-2病毒的核衣壳蛋白(N蛋白)基因与编码SARS-CoV-2病毒的刺突糖蛋白RBD结构域的基因片段融合在一起，构建重组质粒。通过哺乳动物表达系统表达SARS-CoV-2NP连接的S-RBD蛋白。NP连接的S-RBD蛋白包含核衣壳蛋白和刺突糖蛋白RBD结构域。SARS-CoV-2NP连接的S-RBD蛋白可以检测样本中的针对SARS-CoV-2病毒的刺突糖蛋白RBD抗体和针对SARS-CoV-2病毒的核衣壳蛋白(N蛋白)抗体。