[发明专利]用于哺乳动物体系的嵌合型别构转录因子、调控元件组和诱导表达系统

说明书

本发明涉及用于对哺乳动物细胞中感兴趣的基因进行调控的嵌合型别构转录因子以及包含所述嵌合型别构转录因子的调控元件组和诱导表达系统，所述嵌合型别构转录因子包含调控结构域以及转录激活结构域；其中，所述调控结构域选自于由RpaR、BjaR以及BraR所组成的组；所述转录激活结构域选自于P65、VP16、VP64、VTR1、VTR2以及VTR3；所述嵌合型别构转录因子以天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯作为诱导剂；所述天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯选自于由如下化合物所组成的组：对香豆酰基‑高丝氨酸内酯(pC‑HSL)、异戊酰基‑高丝氨酸内酯(IV‑HSL)以及肉桂酰基‑高丝氨酸内酯(Cinn‑HSL)。该系统能以模块化的方式用于多种哺乳动物细胞、组织或生物体，对感兴趣基因的表达进行调控。

技术领域

本发明属于合成生物学和生物工程领域，涉及能够对哺乳动物体系中基因表达进行调控的嵌合型别构转录因子、调控元件组和诱导表达系统。具体而言，本发明涉及使用天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯作为诱导剂来调控宿主细胞中感兴趣基因的转录。

背景技术

对哺乳动物宿主中基因表达的精确调控对于基因功能分析、生物制药、疫苗制备、动物模型设计以及基因治疗等均极为重要。本领域已报道了多种用于哺乳动物的基因表达调控系统，例如用免疫抑制剂或类固醇激素作为诱导剂，来调控目标基因的转录。然而，这些系统普遍存在诱导剂浓度难以控制或者对宿主基因网络造成干扰等问题。为构建与宿主基因调控网络正交的诱导表达系统，已尝试对原核细胞来源的调控元件进行改造并将其转用于真核体系，来诱导表达真核宿主中的基因。例如，可将天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)群体感应受体ScbR或始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)转录因子SpbR与单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)的真核转录激活结构域VP16融合作为转录激活因子，并将相应的操纵序列组装至CMVmini启动子5’端，构建以丁内酯类化合物为诱导剂的哺乳动物诱导表达系统^[1]。然而上述表达系统均为正控阻遏系统，即，在小分子存在下别构转录因子与DNA脱离。WO2007058527A2报道了将原核细胞来源的Tet调控系统转用于哺乳动物体系。在大肠杆菌中，阻遏蛋白TetR与其操纵序列tetO特异性结合抑制下游基因转录，而四环素或强力霉素(dox)与TetR的结合触发构象改变，释放启动子区，开启基因转录。对于真核宿主，可将VP16与TetR融合构建别构转录因子tTA，对包含tetO序列的真核启动子进行调控。然而，四环素或dox与tTA的结合使得该转录因子与启动子区脱离，该系统仍为正控阻遏系统。作为改进，可将TetR部分氨基酸突变，使其与诱导剂结合后与DNA结合，这种负控系统能够被较低浓度的诱导剂(例如44ng/ml强力霉素)激活。

群体感应系统是存在于细菌体内并响应菌群密度信号的系统，通过对信号分子进行合成、分泌、检测以及群体水平应答来实现细胞间通讯，从而协调群体内基因表达。该过程与生物发光、抗生素合成和菌膜形成等密切相关。不同种属的细菌分泌的信号分子在化学结构上具有差异，从而为构建与哺乳动物宿主基因调控网络正交的人工表达系统提供了更多选择。例如，变形菌的群体感应系统利用酰基高丝氨酸内酯(N-acyl homoserinelactone，AHL)作为信号分子，由LuxR家族别构转录因子作为受体对信号分子的浓度信息进行转导。本领域已报道将LuxR家族别构转录因子与真核反式激活域NF-κB p65或VP16融合，构建嵌合转录因子；并将操纵序列添加至CMVmini启动子，构建响应AHL的诱导型启动子^[2]-[3]。目前本领域已报道的此类哺乳动物诱导系统的EC50的量级均在10μM以上，且诱导剂仅限于3-氧代-辛酰基-L-高丝氨酸内酯(3OC8)或3-氧代-己酰基-L-高丝氨酸内酯(3OC6)；这两种直链脂肪酸型AHL的酰基侧链相似度较高，因此基于此类AHL的多通道通讯系统在信号水平和启动子水平上均存在广泛的串扰。

在本发明中，通过对原核生物中以天然氨基酸衍生的酰基高丝氨酸内酯作为诱导剂的群体感应系统进行数据挖掘，识别相应的别构转录因子和操纵序列，并与真核转录调控系统进行整合，构建了用于哺乳动物细胞的新型诱导表达系统。

发明内容