[发明专利]一种高效生产克拉酸的重组大肠杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种高效生产克拉酸的重组大肠杆菌及其应用，属于基因工程、发酵工程和材料科学领域。本发明通过编辑CA合成的关键基因，构建了过量生产CA的突变体；然后通过单因素和响应面法获得最优培养基，并对发酵罐中的发酵条件进行优化。采用本发明的方法制备得到的CA的产量达到19.79g/L，高于已知的最大产量(10.39g/L)，提高了90.47％。此外，对利用本发明的方法制备得到的CA进行了性质的表征，证明其具有优良的性质，如固体形态、分子量、空间结构、链构象、热学和流变学性质等。本发明中CA的高产为规模化生产和CA性质研究提供了夯实的基础，CA性质的揭示为CA的开发利用提供了坚实的理论基础。

技术领域

本发明涉及一种高效生产克拉酸的重组大肠杆菌及其应用，属于基因工程、发酵工程和材料科学领域。

背景技术

天然多糖，特别是具有三螺旋构象的多糖，具有独特的性质和功能比如抗肿瘤、免疫调节等，在食品和药物领域越来越受到关注。因此，多糖的研发在高分子领域具有重要意义。克拉酸(colanic acid，CA)是一种广泛存在于肠道细菌中的胞外保护屏障性多糖，在菌体适应外部环境中起着至关重要的作用。CA在大肠杆菌K-12菌株MG1655中，是由D-半乳糖、L-岩藻糖、D-葡萄糖酸和D-葡萄糖组成的重复单元构成的。据报道，肠道微生物产生的CA可以延长宿主寿命，由此表明CA具有延缓衰老的功能。此外，CA中高含量的L-岩藻糖(约30％)意味着CA在抗炎、抗肿瘤、抗癌、增强免疫力等方面具有巨大的应用潜力。同时，CA改性的纤维素水凝胶具有出色的保水性，使其成为化妆品和医疗保健行业的绝佳选择。

在极端环境或包膜胁迫条件下，大肠杆菌可以合成CA。在我们之前的工作中，我们发现脂多糖(LPS)的截断可以更好地促进CA的合成。此外，CA的生物合成受Rcs磷酸传递系统调控，该系统包括igaA、rcsF、rcsC、rcsD、rcsB和rcsA六个基因。其中，RcsA可以激活CA基因簇并在CA合成中发挥正调节作用。然而，RcsA可以被ATP依赖性蛋白酶Lon(由lon基因编码)水解，故，RcsA的半衰期较短；此外，rcsA还能够被组蛋白HNS(由hns基因编码)沉默(图1)。

CA在多个应用领域有着广阔的发展前景，提高CA产率和揭示CA性质无疑将促进CA更广泛的研究和应用。据报道CA的最高产量为10.39g/L，转化率约为52％(参见Wu,H.,Chen,S.,Ji,M.,Chen,Q.,Shi,J.,Sun,J.(2019).Activation of colanic acidbiosynthesis linked to heterologous expression of the polyhydroxybutyratepathway in Escherichia coli.Int J Biol Macromol,128,752-760.)。此外，目前对CA性质的研究很少，并且大多只关注单糖成分、分子量和流变学性质。因此获得一种能够高产克拉酸(CA)的方法，将促进CA在工业中得到广泛的应用。

发明内容

为了最大程度地提高克拉酸的产量，本发明首先通过编辑CA合成的关键基因，构建了过量生产CA的突变体。然后，通过单因素和响应面法获得最优培养基，并对发酵罐中的发酵条件进行优化。采用本发明的方法制备得到的CA的产量达到19.79g/L，高于已知的最大产量(10.39g/L)，提高了90.47％。此外，对利用本发明的方法制备得到的CA进行了性质的表征，证明其具有优良的性质，如固体形态、分子量、空间结构、链构象、热学和流变学性质等。本发明中CA的高产为规模化生产和CA性质研究提供了夯实的基础，CA性质的揭示为CA的开发利用提供了坚实的理论基础。

本发明提供了一种提高克拉酸产量的方法，所述方法是敲除和表达大肠杆菌基因组上关键基因，获得高产克拉酸菌株。