[发明专利]一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环miRNA标志物及应用

说明书

本发明公开了一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环miRNA标志物，所述miRNA标志物为novel‑miR‑1，其序列为GCAGGUGCGAAAGCAGGUA。所述miRNA标志物，来源于豆状囊尾蚴，并在家兔血清中显著上调表达，可作为豆状囊尾蚴感染的检测靶标。本发明同时公开一种基于与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环miRNA标志物的RT‑qPCR方法。与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环miRNA标志物可应用于豆状囊尾蚴感染的分子检测。novel‑miR‑1来源于豆状囊尾蚴，且在豆状囊尾蚴感染的血清中明显上调，可作为其感染的特异性检测靶标；在豆状囊尾蚴感染的不同时间点的家兔血清中，novel‑miR‑1均明显上调表达，保证了检测结果的稳定性。

技术领域

本发明属于分子诊断或检测技术领域，特别涉及一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环新miRNA(novel-miRNA-1)的鉴定及应用。

背景技术

豆状囊尾蚴(Cysticercus pisiformis)是豆状带绦虫(T.pisiformis)的幼虫，主要寄生于兔等啮齿类动物的肝脏、腹腔和肠系膜等，导致兔的肝脏严重损伤、炎症、腹水以及生长缓慢或体重减轻，严重者甚至死亡。由于该病感染率高，因此对养兔业造成很大的经济损失。由于没有明显的临床症状，该病通常都是通过剖检发现虫体而确诊，致使检测成本很高，造成不必要的浪费，急需建立一种方便快捷的生前诊断技术。也有血清学诊断方法(dot-ELISA)的研究报道，但普遍存在假阳性率高的问题。分子诊断技术具有敏感性和特异性高的特点，但目前仅用于寄生于犬体内的成虫的鉴别诊断。要将分子诊断技术应用于血清样品的检测，必须要有与病原感染相关的特异性诊断标志物。因此，筛选并鉴定与疾病相关的特异性诊断标志物就成了建立血清分子诊断方法的首要任务。

鉴于分子诊断技术具有特异性和敏感性高的特点，因此寻找血清中循环的RNA/DNA作为诊断标志物成为目前研究的热点，而且这方面的研究已在癌症等疾病的诊断中广泛开展。miRNA作为一种短的非编码RNA，不仅与病原感染、病程以及疾病预后密切相关，而且血清中的循环miRNA的水平与病原的感染状态密切相关，且相对稳定。因此，鉴定与豆状囊尾蚴感染密切相关的循环miRNA，从而建立基于miRNA的分子诊断或检测技术，已成为绦虫蚴病诊断的研究热点。

发明内容

本发明旨在提供一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环新miRNA。同时，本发明提供了基于该miRNA的qPCR方法，用于豆状囊尾蚴感染的分子检测。

本发明采用以下技术方案：一种与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环miRNA标志物，所述miRNA标志物为novel-miR-1，其序列为GCAGGUGCGAAAGCAGGUA。

所述miRNA标志物来源于豆状囊尾蚴，并在家兔血清中显著上调表达，可作为豆状囊尾蚴感染的检测靶标。

一种基于与豆状囊尾蚴感染相关的血清循环miRNA标志物的RT-qPCR方法：

设计novel-miR-1的特异性引物：TATACGCAGGTGCGAAAGCAGG；以提取的血清miRNA为模板，用Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit合成miRNA的cDNA第一链；再以novel-miRNA-1的特异性引物和通用的mRQ 3′引物制备如下qPCR反应体系：12.5μl SYBRAdvantage Premix(2×),2μl cDNA,0.5μl ROX Dye(50×),0.5μl novel-miRNA-1引物，0.5μl mRQ 3′引物和9μl无RNase水；反应条件如下：95℃10min，95℃ 15s,60℃ 1min，共40个循环；

以U6 snRNA作为内参基因，合成引物F:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT和R:CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT，用2-ΔΔCt方法计算novel-miRNA-1的相对表达水平。