[发明专利]一种双功能表达载体及嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞

权利要求书

1.SEQ ID NO:1所示序列的siRNA。

2.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的单链可变片段包含MUC1的单链抗体。

3.如权利要求2所述嵌合抗原受体，其特征在于，所述MUC1的抗体为特异性抗胰腺癌细胞MUC1单克隆抗体PAM4；

或，所述嵌合抗原受体的单链可变片段为MUC1的单链抗体，包括轻链可变区及重链可变区，通过接头序列连接；所述铰链区选自IghG1；

或，所述嵌合抗原受体的跨膜结构域来源于CD4，CD8，CD28或CD3ζ中的一种；进一步的，所述跨膜结构选自CD8；

或，所述嵌合抗原受体的信号传导域为FcRγ1胞内区、PI3K的p85亚基胞内区；

或，所述嵌合抗原受体中还包括连接肽、标记基团；进一步的，所述连接肽为P2A，所述标记基团为绿色荧光蛋白EGFP；

进一步的，所述嵌合抗原受体为依次连接的CD8信号肽、抗MUC1单链抗体、myc-tag标记基因、IghG1铰链区、CD8跨膜区、FcRγ1胞内区、PI3K的p85亚基胞内区、P2A和EGFP的融合蛋白；具体的，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

或，所述嵌合抗原受体还包括SEQ ID NO:2第28-1011位氨基酸序列所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:2第1-1011位所示氨基酸序列的突变体；所述突变体包括：与该CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相似性并保留该嵌合抗原受体的生物学活性的氨基酸序列。

4.一种表达框，其特征在于，所述表达框包括权利要求2或3所述嵌合抗原受体的编码序列及shKLF4；

优选的，所述表达框具有如SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体具有如权利要求4所述的表达框；

优选的，所述表达载体类型包括质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒或粘粒；进一步的，所述表达载体为PiggyBac转座子；所述PiggyBac转座子表达载体，该载体含有复制起始位点，3’ITR，5’ITR，权利要求4所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。

6.一种纳米复合物，其特征在于，所述纳米复合物采用甘露糖-壳寡糖-精氨酸高分子材料包覆表达载体；

优选的，所述甘露糖-壳寡糖-精氨酸高分子材料制备方法如下:将壳寡糖与甘露吡喃酰基苯异硫氰酸酯混合得到甘露糖-壳寡糖，将活化后的L-精氨酸加入甘露糖-壳寡糖得到所述甘露糖-壳寡糖-精氨酸材料。

7.一种嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞，其特征在于，所述巨噬细胞膜表面具有权利要求2所述嵌合抗原受体修饰，并且所述巨噬细胞中KLF4表达被抑制；

优选的，所述巨噬细胞中KLF4表达被抑制的方式具体为，通过SEQ ID NO：1所示siRNA进行抑制；

进一步的，所述嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞的制备方式如下：通过将权利要求4所述表达框、权利要求5所述表达载体或权利要求6所述纳米复合物转入巨噬细胞进行表达。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包括权利要求7所述嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞；

优选的，所述组合物中还包括缓冲液、碳水化合物、蛋白质、多肽或氨基酸、抗氧化剂、螯合剂、佐剂或防腐剂中的一种或多种；

优选的，所述药物组合物的施用方式包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植；进一步的，所述组合物可通过皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。

9.权利要求4所述表达框、权利要求5表达载体、权利要求6所述纳米复合物、权利要求7所述嵌合抗原受体修饰的免疫细胞和/或权利要求8所述药物组合物在制备抗肿瘤产品中的应用；

所述抗肿瘤产品包括但不限于药物或模型药物。

10.一种肿瘤的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述治疗方法包括向有治疗需求的患者回输权利要求7所述嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞；

优选的，所述肿瘤包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、神经系统癌症、白血病或宫颈癌中的一种；进一步的，所述嵌合抗体受体修饰的免疫细胞用于胰腺癌的治疗；

优选的，所述治疗方法还包括获取患者的巨噬细胞，向所述巨噬细胞中转入权利要求4所述表达框、权利要求5所述表达载体或权利要求6所述纳米复合物；

优选的，所述免疫细胞治疗方法与其它疗法结合；所述其他疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。