[发明专利]一种双功能表达载体及嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞

说明书

本发明涉及一种双功能表达载体及嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞。本发明全基因合成shKLF4和嵌合抗原受体CD8SP‑抗MUC1sc Fv‑IghG1铰链区‑CD8TM‑FcRγ1‑PI3κ的p85亚基的基因片段插入到PiggyBac载体中，提供了一种靶向MUC1及沉默KLF4的双功能表达载体。所述表达载体包装在MCA高分子材料中对巨噬细胞进行转染，使巨噬细胞表达该嵌合抗原受体。本发明提供的高分子材料的转化方法应用于巨噬细胞的转染具有转化效率高，外源基因能够稳定表达等优点，制备得到的巨噬细胞具有理想的临床应用前景。

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种双功能表达载体、嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞及其在制备抗肿瘤产品中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

胰腺癌(PAAD)是一种高转移性胃肠道肿瘤，被认为是最致命的人类恶性肿瘤之一。PAAD对大多数化疗药物反应不良，手术切除是目前唯一可能治愈的治疗手段。但不幸的是，由于缺乏早期敏感性和特异性抗原，临床确诊的胰腺癌患者中约80％已属中晚期，不可切除治疗。虽然目前已经出现多种PAAD免疫治疗策略，但一些临床试验结果显示，即使是最有希望的免疫检查点抑制剂治疗效果也并未达到预期。胰腺癌肿瘤微环境中缺乏肿瘤浸润淋巴细胞，且致密的肿瘤相关细胞外基质(ECM)和纤维组织阻止CD8⁺ T细胞、NK细胞等免疫效应细胞在肿瘤组织中的浸润。这就导致即使是在血液恶性肿瘤治疗中已取得良好进展的CAR-T技术，在PAAD中的治疗效果却差强人意。

以促进或修改免疫细胞攻击癌细胞为目标的免疫疗法在癌症治疗中发挥着重要作用。近年来，以树突状细胞、T细胞、NK细胞等为基础的过继细胞治疗肿瘤取得了较好的效果，但其在实体肿瘤方面的治疗效果却并不理想。在肿瘤形成的外部环境中，巨噬细胞是先天免疫系统的中枢效应器和调节器，具有吞噬作用、细胞毒性、分泌促炎因子和向T细胞呈递抗原的能力。此外，越来越多的研究表明，在各种类型的癌症中自噬大量上调也能促进细胞死亡。因此发展CAR-巨噬细胞(CAR-Ms)用于肿瘤免疫治疗，以特定CARs修饰人巨噬细胞提高其对肿瘤的吞噬活性和抗原提呈，为治疗实体肿瘤开辟了新的可能性。

嵌合抗原受体(CARs)是一种合成的跨膜受体，主要由胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域三个功能域构成。胞外结构域基本构成为负责识别并结合抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)及一段起连接作用的铰链区(Hinge)，胞内结构域主要由共刺激结构域和信号转导结构域构成，跨膜结构域常由CD3、CD8、CD28构建。CAR可将某种特异性移植到免疫效应细胞(如T细胞、NK细胞)上，并增强其功能，以发挥抗肿瘤疗效。经过不断地研发更新，CAR也在一代至四代的发展中不断完善着。

巨噬细胞是人体免疫系统的重要组成部分，在实体肿瘤微环境中占免疫细胞的30-50％，因此常被称为肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophage,TAM)。巨噬细胞作为专业的抗原呈递细胞(Antigen-presenting cells,APC)，是靶向抗体为基础的实体肿瘤免疫治疗的关键调控细胞和效应细胞，激活的巨噬细胞在促进适应性抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用。相比于其他免疫细胞，如T细胞，易被物理排斥或失活，巨噬细胞具有穿透实体肿瘤的独特能力，可充分浸润肿瘤，促进侵袭和血管生成、转移，增强免疫抑制。这表明，使用CARs对巨噬细胞进行编程，改变巨噬细胞激活和吞噬平衡是一种有前途的治疗途径。

粘蛋白1(MUC1)是一种单通道I型跨膜蛋白，具有高度糖基化的胞外结构域。在癌细胞中，MUC1过表达参与细胞内信号转导通路，并在转录和转录后水平调控其靶基因的表达，促进癌细胞的迁移和侵袭性。由于MUC1在肿瘤组织中的异常表达，且糖基化不足导致肽链暴露，NCI已将其评为高效的肿瘤疫苗设计靶标抗原。新的MUC1特异性抗体PAM4和TAB004也被开发用于肿瘤诊断和治疗。因此作为一种重要肿瘤生物学标志物及治疗靶点，MUC1对肿瘤的免疫治疗具有重要意义。