[发明专利]一种基于PQ500的蛋白DIA绝对定量方法

权利要求书

1.一种基于PQ500的蛋白DIA绝对定量方法，其特征在于，血浆样本依次经过变性还原、烷基化、除盐和酶解步骤制备成多肽，再向多肽中添加PQ500重标肽段，最后使用高效液相色谱和质谱平台对多肽进行DIA采集模式分析，实现血浆中蛋白的DIA绝对定量。

2.根据权利要求1所述的一种基于PQ500的蛋白DIA绝对定量方法，其特征在于，其包括以下详细步骤：

步骤S1，取血清蛋白样品加入8M尿素和1M二硫苏糖醇，37℃反应1h进行变性还原；

步骤S2，血清蛋白样品变性还原后自然冷却至室温，再加入1M碘乙酰胺，室温避光反应30min进行烷基化；

步骤S3，烷基化后再向样品加入50mM碳酸氢铵将尿素浓度稀释至2M，再加入赖氨酰内肽酶在30℃酶切反应2h；

步骤S4，再向样品加入50mM碳酸氢铵将尿素浓度稀释至1M或以下，加入胰蛋白酶在37℃过夜酶解；最后，调节溶液pH至酸性终止酶解；

步骤S5，加入甲醇活化脱盐柱后再加入超纯水平衡脱盐柱，步骤S4中最后获得的肽段加入三氟乙酸酸化至pH值为2-3后加入到已经平衡的脱盐柱中，静置；

步骤S6，向脱盐柱中加入2％甲酸洗去样本中的盐，再加入5％甲醇对脱盐柱进行清洗；

步骤S7，再加入40％NH₄OH乙腈溶液洗脱肽段，将洗脱液冷冻干燥成粉末；

步骤S8，使用0.1％甲酸复融步骤S7获得的肽段粉末，加入PQ500重标肽段，上样进行液相色谱和质谱分析，质谱分析采用DIA采集模式分析。

3.根据权利要求2所述的一种基于PQ500的蛋白DIA绝对定量方法，其特征在于，所述的步骤S1中，尿素的添加量是与血清蛋白样品按体积比1：1的添加；二硫苏糖醇添加后的终浓度是20mM；所述的步骤S2中，碘乙酰胺添加后的终浓度是50mM；所述的步骤S3中，赖氨酰内肽酶的添加质量比例是样品：赖氨酰内肽酶＝50：1；所述的步骤S4中，胰蛋白酶的添加质量比例是样品：胰蛋白酶＝50：1。

4.根据权利要求3所述的一种基于PQ500的蛋白DIA绝对定量方法，其特征在于，所述的步骤S5中，重复两次加入超纯水平衡脱盐柱；所述的步骤S6中，重复两次加入2％甲酸进行脱盐；所述的步骤S7中，重复两次加入40％NH₄OH乙腈溶液洗脱肽段，并合并洗脱液。

5.根据权利要求3所述的一种基于PQ500的蛋白DIA绝对定量方法，其特征在于，所述的步骤S8还包括步骤S81，复融肽段粉末后测定肽段浓度。

6.根据权利要求3所述的一种基于PQ500的蛋白DIA绝对定量方法，其特征在于，所述的液相色谱的条件如下：色谱柱为C18(75μm*200mm)，流动相A为0.1％FA水溶液，流动相B为0.1％FA乙腈溶液。

7.根据权利要求6所述的一种基于PQ500的蛋白DIA绝对定量方法，其特征在于，所述的质谱条件如下：120min DIA检测，数据在正离子模式下进行采集，Full MS中分辨率为60K，AGC为3e6，最大进样时间为50ms，扫描范围：350-1650m/z；DIA中分辨率为15K，AGC为3e6，最大进样时间为auto，归一化碰撞能量(NCE)为27％。