[发明专利]一种基于PQ500的蛋白DIA绝对定量方法

说明书

本发明提供一种基于PQ500的蛋白DIA绝对定量方法，属于血液样本中蛋白定量技术领域，通过在血浆样本中掺入PQ500(包含804条稳定同位素标记的合成肽段，对应血液中581个蛋白)结合DIA采集模式，实现血浆中蛋白的DIA绝对定量，本发明提供的蛋白定量方法可以消除批次间误差，具有高通量、高重现性、高定量准确度的特点。

技术领域

本发明属于血液样本中蛋白定量技术领域，尤其涉及一种基于PQ500的蛋白DIA绝对定量方法。

背景技术

在生物标志物的研究中，通常可获得的样本有组织、细胞和体液。体液包括血浆、血清、全血、尿液、唾液等。从靶向器官中提取组织和细胞的方法对病人而言具有侵略性，因此不适用于大范围的研究分析。采集体液是相对无痛的一种手段，得益于容易采集、成分稳定、操作简单等优点，从血液中寻找生物标志物是最普遍的一种方法。

基于质谱的蛋白质组学技术分为靶向和非靶两种模式。非靶向的发现型研究得到的是鉴定蛋白的相对定量信息，而靶向分析得到的则是少量蛋白的绝对定量信息。靶向定量蛋白质组学例如PRM可同时对几十至上百种蛋白进行定量，不过其通量往往还是低于非靶向相对定量的模式。目前绝对定量蛋白质组学主要是以同位素肽段为内标的靶向定量蛋白质组学。

传统的数据依赖采集(Data-Dependent Acquisition，DDA)模式有数据缺失多、不利于低丰度蛋白检测、重现性差，定量不够精准等固有缺点，而新近发展起来的数据非依赖采集模式(Data-Independent Acquisition，DIA)在实现非靶向蛋白的全面鉴定的同时，还能获得和靶向蛋白质组学相媲美的定量准确性。目前DIA都是相对定量，在多个批次间样本的定量中会存在批间差异。

发明内容

基于现有技术中存在上述问题，本发明提供一种基于PQ500的蛋白DIA绝对定量方法，通过在血浆样本中掺入PQ500(包含804条稳定同位素标记的合成肽段，对应血液中581个蛋白)结合DIA采集模式，实现血浆中蛋白的DIA绝对定量，该方法可以消除批次间误差，具有高通量、高重现性、高定量准确度的特点。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于PQ500的蛋白DIA绝对定量方法，血浆样本依次经过变性还原、烷基化、除盐和酶解步骤制备成多肽，再向多肽中添加PQ500重标肽段，最后使用高效液相色谱和质谱平台对多肽进行DIA采集模式分析，实现血浆中蛋白的DIA绝对定量。

根据以上方案，所述的一种基于PQ500的蛋白DIA绝对定量方法包括以下详细步骤：

步骤S1，取血清蛋白样品加入8M尿素和1M二硫苏糖醇(DTT)，37℃反应1h进行变性还原；

步骤S2，血清蛋白样品变性还原后自然冷却至室温，再加入1M碘乙酰胺(IAA)，室温避光反应30min进行烷基化；

步骤S3，烷基化后再向样品加入50mM碳酸氢铵(ABC)将尿素浓度稀释至2M，再加入赖氨酰内肽酶(Lys-C)在30℃酶切反应2h；

步骤S4，再向样品加入50mM碳酸氢铵(ABC)将尿素浓度稀释至1M或以下，加入胰蛋白酶(Trypsin)在37℃过夜酶解；最后，调节溶液pH至酸性终止酶解；

步骤S5，加入甲醇活化脱盐柱后再加入超纯水平衡脱盐柱，步骤S4中最后获得的肽段加入三氟乙酸(TFA)酸化至pH值为2-3后加入到已经平衡的脱盐柱中，静置；

步骤S6，向脱盐柱中加入2％甲酸(FA)洗去样本中的盐，再加入5％甲醇对脱盐柱进行清洗；

步骤S7，再加入40％NH₄OH乙腈溶液洗脱肽段，将洗脱液冷冻干燥成粉末；