[发明专利]制备在利用核酸聚合酶来检测核酸时使用的高精度核酸的方法

说明书

本发明涉及一种制备具有高灵敏度的核酸的方法，其中在用于检测痕量核酸的聚合反应(如PCR反应、实时定量PCR或类似反应)之前使用核酸聚合酶向待用于分析的核酸中加入终止子，使得可以基本上消除与靶核酸的扩增反应争性地出现的非特异性引发，从而精确地仅检测痕量的靶核酸并精确地测量靶核酸的浓度。

本申请是申请日为2013年4月8日的中国发明专利申请201380029805.2(PCT申请号PCT/KR2013/002895)的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种制备在通过核酸聚合酶来检测核酸时使用的、具高灵敏度的核酸的方法，更具体而言，本发明涉及一种制备核酸的方法，所述核酸通过防止非特异性核酸聚合而能够检测痕量核酸，所述非特异性核酸聚合是由于包含在提取自生物样品的核酸中的单链核酸引起自引发(self-priming)所诱发，制备在核酸检测中用于检测核酸的核酸样品的方法在室温下使用PCR、RT-PCR、定量PCR、定量RT-PCR、转录扩增或核酸扩增所需的核酸聚合酶和引物。

背景技术

各种利用核酸聚合酶来检测核酸的方法以高灵敏度和特异性已被用于各种检查，例如针对病毒、病原体、致癌基因等的测试。高灵敏度可以通过利用检测用的核酸聚合酶将靶核酸的数量扩增到上亿或更多来实现。高特异性可通过利用与靶核酸特异性杂交的引物，以在杂交温度下经由与靶核酸选择性地杂交，通过引发(priming)而选择性地进行核酸聚合反应来实现。然而，在诸如PCR反应、实时定量PCR反应等的具有多种核酸聚合酶的检测方法中，对于检测痕量的核酸而言，非特异性引发和随后的聚合反应扮演着劣化检测极限的主要因素。由于添加的引物与用于引发反应的靶核酸杂交，并且以众多数量竞争性存在的单链核酸非特异性地且部分地杂交而引发，使得核酸聚合反应竞争性地出现，故造成非特异性扩增。

与针对DNA的检测相比，针对大多数包括单链核酸的RNA的检测通常以较小灵敏度进行。一般而言，用于检测RNA的方法通过逆转录(RT)反应接着PCR反应来进行。对于具有高灵敏度的反应而言，RT反应首先在一个反应器中进行，在RT反应完成后，在单独的反应器中利用RT反应产物进行PCR反应。

然而，在这种情况下，由于反应管需要再次打开以添加溶液，这不方便的且当打开反应管并进行操作时有被污染的高度可能性，故而主要使用通常在一个管中包括逆转录酶接着PCR反应的逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)方法。然而，在这种情况下，与分别进行反应的情况相比，存在灵敏度大大劣化的问题。

逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)在进行逆转录反应时需要引物，其中有使用随机引物的方法和使用作为靶特异性引物的反义引物的方法。

使用随机引物的方法能够制备关于全部核酸的cDNA，因而已被主要用于制备cDNA库或用于分析转录组的cDNA。然而，在检测痕量RNA的情况下，由于合成了关于全部RNA的cDNA而制备了许多非靶cDNA，故非靶DNA的量过度增加，使得难以如上所述地检测到靶。需要如上所述的高灵敏度的检测(如RNA病毒诊断试剂盒)通常采用一种利用与靶RNA互补的反义引物的方法。

靶特异性反义引物通常能够提高检测极限。然而，即使使用靶特异性引物，由于在含有室温下对RNA具有高活性的逆转录酶的混合反应溶液中，在低于引物杂交温度的温度下发生非特异性引发以及随后的逆转录酶反应是不可避免的，故出现了制备出许多非特异性cDNA的问题。

一种被开发来克服上述问题并检测痕量的核酸的技术是热启动PCR反应。热启动PCR反应是一种包括在低温下的样品混合过程以控制不起始PCR反应，然后仅在靶特异性引物的杂交温度以上活化PCR反应的方法。