[发明专利]一种可诱导自然杀伤细胞缺陷小鼠模型的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种针对小鼠Ncr1基因的gRNA，利用所述gRNA，进一步将包含重组左臂、核糖体接入位点（IRES）、白喉毒素受体（DTR）和绿色荧光蛋白（EGFP）融合编码序列、重组右臂的同源重组载体同源重组到小鼠Ncr1基因，构建了一个Ncr1‑IRES‑DTR‑EGFP基因修饰小鼠模型。该模型可以实现小鼠内源Ncr1基因驱动白喉毒素受体和绿色荧光蛋白在NK细胞的表达，利用该模型，可以实现小鼠自然杀伤细胞缺陷的可诱导，实现小鼠NK细胞的可诱导缺失，并通过EGFP荧光表达标记小鼠NK细胞。本发明公开的构建可诱导自然杀伤细胞缺陷小鼠模型的方法以及采用所述方法建立的模型对于NK细胞功能研究等领域具有重要的意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可诱导自然杀伤细胞缺陷小鼠模型的构建方法及应用。

背景技术

自然杀伤细胞（natural killer cell）是一种细胞质中具有大颗粒的细胞，简称NK细胞（NK cell），也称作大颗粒淋巴细胞（LGL, Large Granular Lymphocytes）。由骨髓淋巴样干细胞发育而成，主要分布于外周血和脾脏，在淋巴结和其他组织中也有少量存在。自然杀伤细胞可通过直接和陌生细胞接触，分泌穿孔素及肿瘤坏死因子，以细胞膜破裂的方式杀死目标细胞。因为其非专一性的细胞毒杀作用而被命名。

NK细胞是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、 抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。在抗肿瘤研究中，NK细胞扮演关键角色，NK细胞有两方面抗癌作用，一是上述的对肿瘤细胞的直接杀伤，通过释放后穿孔素和颗粒酶或通过死亡受体杀死肿瘤细胞；二是它通过分泌细胞因子和趋化因子扮演免疫系统的调节细胞角色，激活T细胞等的杀伤作用。目前用于肿瘤免疫治疗的NK细胞策略有：体外活化的自体或异体NK细胞治疗；联合NK细胞和单抗药（如免疫检查点抑制剂）来诱导抗体特异的细胞毒性；构建CAR-NK细胞免疫疗法等。

在体内特异性的剔除某一类细胞，是研究该类细胞在体内功能的一种有效方法。为了更好的研究NK细胞的作用和功能，研究人员开发了多种NK细胞缺陷小鼠模型，如Beige小鼠、NSG小鼠、Perforin基因缺失小鼠等。Beige小鼠是最早发现的NK细胞功能缺陷小鼠模型之一，缺陷原因是因为小鼠自发点突变，造成其在天然细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性中均缺乏NK细胞裂解细胞的功能；NSG小鼠是一种T,B,NK细胞均缺失的小鼠重度免疫缺陷小鼠类型，该模型因为Il2rg基因缺陷导致NK细胞缺失；Perforin基因敲除小鼠模型的NK细胞，对MHC-I分子缺失细胞的杀伤能力显著下降。这些NK细胞缺陷模型无论是NK细胞杀伤能力的缺陷，还是NK细胞数量的减少，都广泛应用于NK细胞发育、驯化机制研究和NK细胞生物医药研发，但这些模型中NK细胞的缺陷是小鼠生来就有的免疫缺陷，这种长期的免疫缺陷可能导致机体本身适应性的代偿和小鼠本身其他免疫方面的异常，导致研究结果的误读。因此，迫切需求有一种可诱导性的NK细胞缺陷小鼠模型，其可以在诱导剂的作用下，在特定时间内造成NK细胞缺失，在其他时间段内，NK细胞维持正常状态，用于NK细胞的研究。