[发明专利]OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用

权利要求书

1.OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用，其特征在于：敲除水稻中OsFWL7基因以增加水稻籽粒金属微量元素含量，所述OsFWL7基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述金属微量元素为Mn和Cu。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述敲除水稻中OsFWL7基因的具体方法为：利用CRISPR/Cas9技术靶向突变水稻中的OsFWL7基因。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体步骤为：

1)在水稻OsFWL7基因的编码区选取靶标序列；

2)根据靶标序列合成带有粘性末端的接头引物，构建用于OsFWL7基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体；所述重组载体包括能在水稻细胞中表达的具有所述靶标序列的sgRNA表达盒和Cas9核酸酶表达盒；

3)将所述重组载体转入根癌农杆菌工程菌株中，利用农杆菌介导法转化常规水稻品种，获得转基因水稻植株；

4)利用覆盖靶标位点的基因组引物对转基因植株基因组DNA进行扩增和序列测定，从而对T₀代转基因植株进行基因型鉴定，获得纯合或双等位突变体；

5)对纯合突变体在T₁代进行种植，利用引物对T₁代植株中的HPT、sgRNA和Cas9转基因进行PCR检测，即可获得无转基因插入、籽粒Mn和Cu含量显著增加的水稻。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1)中，所述靶标序列有两个，其序列如SEQ ID No.6或SEQ ID No.7。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中，所述具有所述靶标序列的sgRNA表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；所述Cas9核酸酶表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤5)中，用于HPT、sgRNA和Cas9转基因扩增的引物序列分别为：

HPTF：5’-GGGTGTCACGTTGCAAGACC-3’，

HPTR：5’-ATGCCTCCGCTCGAAGTAGC-3’，

sgRNAF：5’-TCCCAGTCACGACGTTGTAA-3’，

sgRNAR：5’-GGCCATTTGTCTGCAGAAT-3’，

Cas9F：5’-CACCATCTACCACCTGAGAA-3’，

Cas9R：5’-CGAAGTTGCTCTTGAAGTTG-3’。