[发明专利]OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用

说明书

本发明公开了OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用，属于分子生物学及基因工程技术领域。本发明通过设计水稻OsFWL7基因编码区基因敲除靶标位点，利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除突变体，敲除水稻中的OsFWL7基因。通过后代分离和检测，获得了无转基因插入的纯合突变体。不同突变体单株产量与野生型相比无显著差异，但糙米中金属微量元素锰和铜的含量与对照相比显著增加，具有更好的营养品质。因此，本发明提供的敲除水稻OsFWL7基因以强化籽粒金属微量元素的方法，具有重要的应用价值，能产生良好的经济效益。

技术领域

本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，涉及OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用。

背景技术

金属元素锰(Mn)和铜(Cu)是人体所必须的微量元素，对于人体发育和生命健康至关重要。Mn是细胞水解酶、激酶、脱羧酶、转移酶等多种酶的激活因子，广泛参与骨骼形成、能量生成、蛋白质和脂肪代谢等过程。Mn缺乏影响人类生殖和智力发育，引起神经衰弱等症状。Cu除了可以促进铁的吸收利用，还有助于血压控制和预防氧化损伤，并参与生殖和激素合成等。Cu缺乏引起免疫缺陷、贫血和骨质疏松等疾病。当前，世界上有超过20亿人口Mn、Cu等微量元素摄入不足。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球近一半的人口以稻米为主食。因此，培育高积累金属微量元素的水稻品种是保障金属微量元素摄入的有效手段。然而，传统育种方法周期长、效率低、速度慢。利用生物技术手段改良水稻品种是加快培育微量元素强化水稻品种的可行策略。

FW2.2-like(FWL)蛋白是一类新发现的金属转运体，参与多种金属离子的运输。拟南芥FWL基因AtPCR2编码Zn输出转运体，参与Zn长距离运输。在水稻中过表达普通小麦FWL基因TaCNR2和TaCNR5以及二倍体小麦FWL基因TuCNR10显著提高糙米中Zn和Mn含量。水稻OsFWL5基因敲减植株糙米中Zn和Mg含量显著增加，但Mn含量下降。此外，OsFWL4敲减植株糙米中Mn含量下降。

CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated protein 9)系统是一种由导向RNA介导的基因组定向编辑系统，广泛应用于各种生物的基因组编辑中。利用该系统在很多植物中都实现了在一代内获得稳定的纯合突变体。由于T-DNA插入位点和突变位点位于不同位置，在基因编辑后代中可以将T-DNA分离除去，获得无转基因插入的突变体，从而规避转基因可能带来的安全风险。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用，即敲除水稻中OsFWL7基因以增加水稻籽粒金属微量元素含量的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用：敲除水稻中OsFWL7基因以增加籽粒金属微量元素含量，所述OsFWL7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述金属微量元素为Mn和Cu。

优选地，所述敲除水稻中OsFWL7基因的具体方法为：利用CRISPR/Cas9技术靶向突变水稻中OsFWL7基因。

优选地，所述的应用具体步骤为：

1)在水稻OsFWL7基因的编码区选取靶标序列；

2)根据靶标序列信息，合成带有粘性末端的接头引物，构建用于OsFWL7基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体；所述重组载体包括能在水稻细胞中表达的具有所述靶标序列的sgRNA表达盒和Cas9核酸酶表达盒；

3)将所述重组载体转入根癌农杆菌工程菌株中，利用农杆菌介导法转化常规水稻品种，获得转基因水稻植株；