[发明专利]一种斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法

权利要求书

1.一种斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法，其特征在于：包括以下步骤，

（1）池塘分为有机肥池塘、无机肥和复合肥池塘和不施肥池塘，均投放斑点叉尾鮰鱼种后投喂漂浮性颗粒配合饲料，养殖两个半月后收集斑点叉尾鮰样本，采集斑点叉尾鮰肠道微生物，提取微生物总DNA；所述有机肥池塘施加多功能生物1型水产专用肥，总养分≥5％，有机质≥54％；所述无机肥和复合肥池塘按照20kg/公顷N和2kg/公顷P施加尿素和复合肥，所述复合肥元素比N:P₂O₅:K₂O＝16:16:16；

（2）以总DNA为模板，针对乳杆菌属 Lactobacillus 种群16S rDNA基因的V3-V4可变区进行设计引物，进行PCR扩增，若扩增产物没有1054bp条带，则判定养殖池塘使用的是无机肥；所述引物，其正向引物SEQ ID NO:1序列为5'-TCTGGTATTGATTGGTGCTTG-3'，反向引物SEQ ID NO:2序列为5'-GCGGGACTTAACCCAACATC-3'。

2.如权利要求1所述的斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法，其特征在于：步骤（2）中，所述进行PCR扩增，其反应体系为50 mL：1 mL 50ng/μL模板DNA；PCR缓冲液 5 mL；dNTP混合液4mL；10 μmol/L上、下游引物各1 mL，2mL 2 IU Taq酶；双蒸水36mL；

所述PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0， 0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl₂ ，0.01%明胶组成；

所述dNTP混合液4mL，其中每种dNTP 0.1mmol/L。

3.如权利要求1所述的斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法，其特征在于：步骤（2）中，所述进行PCR扩增，其扩增反应程序为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，经30个循环后再72 ℃延伸10 min。