[发明专利]结核分枝杆菌融合蛋白AR2及其构建与表达纯化方法和应用

权利要求书

1.结核分枝杆菌融合蛋白AR2的构建与表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤，

S1：从结核分枝杆菌H37Rv全基因组序列中提取Rv1988及Rv1886c编码的基因序列；

S2：以pET28a、pET30b作为载体，构建pET30b-Rv1988重组质粒和pET28a-Rv1886c重组质粒；

S3：根据提取的Rv1988及Rv1886c基因序列合成Rv1988-Rv1886c，也即融合蛋白AR2的融合基因；

S4：以质粒pET28a作为载体，构建重组质粒pET28a-AR2；

S5：将步骤S2和步骤S4中构建的重组质粒转入表达载体E.coli BL21菌株中；

S6：融合蛋白AR2及亚组份蛋白rRv1988、rRv1886c的表达与纯化。

2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白AR2的构建与表达纯化方法，其特征在于，步骤S2的具体操作包括以下步骤，

S201：参照原核表达载体pET28a、pET30b的多克隆位点设计Rv1988及Rv1886c对应的引物，以H37Rv基因组作为模板进行PCR基因扩增；

S202：对PCR基因扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；

S203：目的基因Rv1988和Rv1886c回收与验证；

S204：将回收的目的基因Rv1988、Rv1886c，以及原核表达载体pET28a、pET30b分别进行双酶切；

S205：对双酶切反应液进行纯化；

S206：将纯化后的双酶切产物进行连接，Rv1988与质粒pET30b连接，Rv1886c与质粒pET28a连接；

S207：将步骤S206中得到的两个连接体系分别转入大肠杆菌E.coli DH5α菌株中，置于LB固体培养基上培养，待其长出菌落，每个菌落即为一个单克隆；

S208：于超净台内取高压灭菌的洁净玻璃试管，向其中加入LB液体培养基和抗生素，挑取步骤S207中培养得到单克隆置于液体培养基中，将试管置于摇床内摇菌；

S209：从步骤S208的液体培养基中抽提pET30b-Rv1988重组质粒和pET28a-Rv1886c重组质粒。

3.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白AR2的构建与表达纯化方法，其特征在于，步骤S202的具体操作包括以下步骤，

1)：1％琼脂糖凝胶的制备；以万分之一天平称取琼脂糖0.2g至烧杯，取20ml 1×TAE溶液，倒入烧杯内，微波炉中火加热1min；取出，待冷却至50℃时，加2μl Gelview染料，摇匀，倒入制胶模具中；室温冷却30min，得1％琼脂糖凝胶，将其取出置于水平电泳槽内；

2)：加样；在1％琼脂糖凝胶的胶孔内加入4μl核酸标志物Marker DL2000，25μlPCR基因扩增产物；

3)：电泳；打开电泳仪，并与电泳槽通电，调整电泳仪电压为100V，电流为100mA，电泳时间设置为25min，Start开始电泳；

4)：成像；电泳仪提示结束后关闭仪器，取出电泳完成的琼脂糖胶，将其置于Bio-Rad凝胶成像系统ChemiDoc XRS+中，运行成像并拍照保存。

4.根据权利要求3所述的结核分枝杆菌融合蛋白AR2的构建与表达纯化方法，其特征在于，步骤S205的具体操作包括以下步骤，

1)：将双酶切产物装入洁净1.5ml EP管，以无菌水补至100μl，再向其中加入500μl含有异丙醇的缓冲液中，充分混匀；

2)：混匀后移至吸附柱内，以转速为8000rcf离心30s，将流出液再移至吸附柱内，8000rcf离心30s，弃流出液；

3)：将500μl含有乙醇的漂洗液加入到吸附柱内，9000rcf离心30s，弃流出液；

4)：重复操作步骤3)；

5)：将空吸附柱以转速为9000rcf离心1min；

6)：开盖，室温放置5min以挥发残留乙醇；

7)：于水浴锅预热洗脱缓冲液至60℃；

8)：向吸附柱膜中央加入35μl预热至60℃的洗脱缓冲液，40℃静置温浴2min，以转速为9000rcf离心1min，得洗脱液，取3.5μl进行验证，余下于-20℃保存备用。