[发明专利]结核分枝杆菌融合蛋白AR2及其构建与表达纯化方法和应用

说明书

本发明公开了结核分枝杆菌融合蛋白AR2及其构建与表达纯化方法和应用，所述构建与表达纯化方法包括以下步骤，S1：从结核分枝杆菌H37Rv全基因组序列中提取Rv1988及Rv1886c编码的基因序列；S2：以pET28a、pET30b作为载体，构建pET30b‑Rv1988重组质粒和pET28a‑Rv1886c重组质粒；S3：根据提取的Rv1988及Rv1886c基因序列合成Rv1988‑Rv1886c，也即融合蛋白AR2；S4：以质粒pET28a作为载体，构建重组质粒pET28a‑AR2；S5：将步骤S2和步骤S4中构建的重组质粒转入表达载体E.coli BL21菌株中；S6：融合蛋白AR2及亚组份蛋白rRv1988、rRv1886c的表达与纯化，将本发明中的融合蛋白AR2和佐剂进行联合构建结核亚单位疫苗，该疫苗可在小鼠体内诱导较强的细胞免疫应答并促进记忆性T细胞的产生，后期有望成为更为有效的结核病新型候选疫苗。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及结核分枝杆菌融合蛋白AR2及其构建与表达纯化方法和应用。

背景技术

结核分枝杆菌(MTB)是结核病的病原体，是人类病原体中最能适应人体环境的一种，它可以以潜伏状态在人体巨噬细胞内长时间存活。据估计，全球有三分之一的人口存在结核分枝杆菌潜伏感染，其中这一人群中有10％的人口在免疫功能低下时由潜伏期结核进展为活动性结核。对于结核病的控制策略很大程度上依赖于疾病的诊断和至少三种不同抗痨药物长期的治疗。但这导致了多重耐药结核的不断发展。另外，由于艾滋病病毒的流行，并发的结核分枝杆菌感染也逐渐成为亟待解决的问题。全球结核病对公共卫生健康的影响日益严重，迫切需要研制一种新的抗结核疫苗。

目前所使用的结核疫苗卡介苗(BCG)，自1921年开始应用于临床，是一种减毒牛结核分枝杆菌活疫苗。研究证实，它能够有效预防新生儿和儿童患严重的脑膜结核及全身粟粒性结核病，但是不能有效的防止成人肺结核的发生。继BCG疫苗应用80多年以来，全球尚未研制出有效的新型抗结核疫苗。因此，为了在全球范围内彻底消灭结核病，我们迫切需要研制更为有效的结核病新型疫苗。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明旨在提供结核分枝杆菌融合蛋白AR2及其构建与表达纯化方法和应用，通过一种全新的结核分枝杆菌融合蛋白AR2和佐剂进行联合构建结核亚单位疫苗，该疫苗可在小鼠体内诱导较强的细胞免疫应答并促进记忆性T细胞的产生，后期有望成为更为有效的结核病新型候选疫苗。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

结核分枝杆菌融合蛋白AR2的构建与表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤，

S1：从结核分枝杆菌H37Rv全基因组序列中提取Rv1988及Rv1886c编码的基因序列；

S2：以pET28a、pET30b作为载体，构建pET30b-Rv1988重组质粒和pET28a-Rv1886c重组质粒；

S3：根据提取的Rv1988及Rv1886c基因序列合成Rv1988-Rv1886c，也即融合蛋白AR2的融合基因；

S4：以质粒pET28a作为载体，构建重组质粒pET28a-AR2；

S5：将步骤S2和步骤S4中构建的重组质粒转入表达载体E.coli BL21菌株中；

S6：融合蛋白AR2及亚组份蛋白rRv1988、rRv1886c的表达与纯化。

进一步的，步骤S2的具体操作包括以下步骤，

S201：参照原核表达载体pET28a、pET30b的多克隆位点设计Rv1988及Rv1886c对应的引物，以H37Rv基因组作为模板进行PCR基因扩增；

S202：对PCR基因扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；