[发明专利]一种痕量单链核酸样本制备方法

权利要求书

1.一种痕量单链核酸样本制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）获取碎片化的，且经过5’端磷酸化和3’端羟基化处理的DNA单链或者cDNA；（2）步骤（1）得到的DNA片段进行3’端辅助连接，延伸成DNA双链；具体如下：体系中使用一种人工合成的核苷酸片段辅助子，以及dNTP，且dNTP是普通的dNTP和热启动dNTP的混合物，普通dNTP选用四种dNTP中的任一种，热启动的dNTP为选用的普通dNTP对应剩余的三种，反应体系中还含有加尾酶、DNA聚合酶；辅助子3’端含有与DNA片段加尾互补的序列，且3’末端需要进行封闭，以防止体系中的加尾酶对辅助子进行3’加尾，延伸时解除3’末端的封闭；辅助子3’端至少第1个碱基采用RNA碱基进行封闭；所述的RNA碱基为rA、rG、rC或rU；首先在20℃-37℃条件下进行DNA片段的加尾反应5-30分钟；然后在90℃-95℃反应1-5分钟，使热启动的dNTP进入到激活工作的状态,同时使辅助子3’端的RNA碱基从辅助子上掉下来，激活辅助子的延伸功能；再在45℃-72℃反应2-30分钟，使辅助子与DNA片段3’端加尾序列互补结合，之后由DNA聚合酶分别以辅助子和DNA片段为模板向前延伸，直至以辅助子为模板延伸出辅助子的互补链，并且以DNA片段为模板延伸出DNA片段的互补链；（3）步骤（2）得到的DNA双链的5’端连接上接头，然后进行双模板底物扩增；

步骤（2）中：DNA片段3’端加尾序列长度3-20个碱基，辅助子3’端与DNA片段加尾序列互补结合的碱基序列在辅助子3’端RNA碱基之后直到第14个碱基中的任意部分；

体系中辅助子浓度为10nM-20μM；

反应体系中DNA片段量1fmol-1nmol/50μL；

体系中普通dNTP的浓度为2μM-2mM；体系中普通dNTP浓度是每一种热启动dNTP的1倍-3倍；

体系中加尾酶的浓度为0.15U/μL-15U/μL；体系中聚合酶的浓度为0.01U/μL-2U/μL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中得到的DNA片段长度10nt-1000nt。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中：辅助子长度15nt-120nt。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中：辅助子长度30nt-60nt。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过限制普通dNTP的量和/或增加辅助子的量来控制DNA片段3’端加尾碱基数目，随着普通dNTP的浓度降低，则DNA片段3’端加尾碱基数目会减少；随着辅助子的浓度增加，则DNA片段3’端加尾碱基数目会减少。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，体系中辅助子浓度为50nM-10μM。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，体系中辅助子浓度为100nM-5μM。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，体系中普通dNTP的浓度为10μM-1mM。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，体系中普通dNTP的浓度为30μM-0.5mM。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，体系中对于DNA片段加尾实现方式，包括：使用加尾酶，以体系中加入的普通dATP、dTTP、dGTP和dCTP，4种dNTP中的任一种为材料进行DNA片段的3’端加尾；体系中用于聚合的聚合酶包括Taq聚合酶中的至少一种，或者高保真聚合酶中的至少一种；Taq聚合酶包括：2G Robust DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶、TaqB DNA聚合酶中的一种或几种，高保真聚合酶包括：kapa HIFI热启动高保真聚合酶、pfu DNA聚合酶、phusion DNA聚合酶中的一种或几种。