[发明专利]一种痕量单链核酸样本制备方法

说明书

本发明公开了一种痕量单链核酸样本制备方法。包括以下步骤：（1）获取碎片化的，且经过5’端磷酸化和3’端羟基化处理的DNA单链或者cDNA；（2）步骤（1）得到的DNA片段进行3’端辅助连接，延伸成DNA双链；（3）步骤（2）得到的DNA双链的5’端连接上接头，然后进行双模板底物扩增。本发明提高了制备痕量核酸样本的效率，并且减少了纯化步骤，对痕量的DNA起始原料测序前处理意义重大。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种痕量单链核酸样本制备方法。

背景技术

核酸是脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的总称，是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。在天然存在的核酸中核糖核酸（RNA）多以单链形式和发夹形式存在，也发现少量以环状形式存在。脱氧核糖核酸（DNA）则以双螺旋的双链形式存在为主，也有部分以单链形式存在。在生物技术诸如核酸检测、体外诊断、基因测序等领域中，对核酸的各种处理过程中也会产生单链形式的核酸。比如，自然界中存在以单链DNA或单链RNA为遗传物质的生物如人类输血传染病毒（TTV）和微小病毒等等。对这些生物的遗传物质的测序研究使用传统的NGS测序前样本处理方法不容易实现。在法医领域，从腐烂的各种人源材料如骨骼、指甲、毛发等中提取出的DNA或RNA往往已经高度降解成了单链碎片化核酸，并且已经是痕量（如pg或者fg级别）。对这些痕量的碎片化核酸目前还没有一个高效的样本制备手段。 此外，在进行DNA甲基化检测中也会涉及到将DNA进行重盐转换的步骤，重盐转换后的DNA绝大部分变成了比较短的碎片化单链DNA。对这些单链核酸的处理目前也缺少一个特别高效的技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以对痕量核酸（DNA或RNA）进行样本制备的方法。该方法不依赖于DNA的双链结构。该方法样本制备效率高，广泛适用于各种长度的痕量单链或双链DNA及RNA。

一种痕量单链核酸样本制备方法，包括以下步骤：

（1）获取碎片化的，且经过5’端磷酸化和3’端羟基化处理的DNA单链或者cDNA；

（2）步骤（1）得到的DNA片段进行3’端辅助连接，延伸成DNA双链；具体如下：

体系中使用一种人工合成的核苷酸片段辅助子，以及dNTP，且dNTP是普通的dNTP和热启动dNTP的混合物，普通dNTP选用四种dNTP中的任一种、两种或者三种，热启动的dNTP为选用的普通dNTP对应剩余的三种、两种或者一种；在较低温度条件下利用所述的普通dNTP进行DNA片段的加尾反应；然后给体系一个较高的温度，使热启动的dNTP进入到激活工作的状态；再给一个相对较低的温度，使辅助子与DNA片段3’端加尾序列互补结合，最后由DNA聚合酶分别以辅助子和DNA片段为模板向前延伸，直至以辅助子为模板延伸出辅助子的互补链，并且以DNA片段为模板延伸出DNA片段的互补链，辅助子3’端含有与DNA片段加尾互补的序列，且3’末端需要进行封闭，以防止体系中的加尾酶对辅助子进行3’加尾，延伸时解除3’末端的封闭；

（3）步骤（2）得到的DNA双链的5’端连接上接头，然后进行双模板底物扩增。

核酸碎片化：本发明的起始模板可以是双链或单链DNA，也可以是RNA。可以是各种长度为10bp-1000bp。优选50bp-800bp，进一步优选100bp-300bp。如果是太长的DNA或RNA则首先需要进行碎片化处理。碎片化处理的方案可以是基因检测行业内常用的方案。例如，长双链DNA可以使用超声破碎的方法，内切酶酶切的方法等。长链RNA可以使用二价金属离子加95℃以上高温处理的方法等。不仅限制于以上举例的处理方法，凡是能够对核酸进行有效碎片化处理的方法均可。如果核酸本身已经是较短的片段则不需要再进行碎片化处理。