[发明专利]点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP及其应用

说明书

本发明提供点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白的应用，属于基因工程领域。根据本发明提供的RpSDP基因的dsRNA制剂，将其导入点蜂缘蝽体内，可有效地杀灭点蜂缘蝽，避免其为害农作物。本发明特异地针对点蜂缘蝽，对哺乳动物、鱼虾类、天敌昆虫和授粉昆虫无害，具有见效快、致死率高、环境友好等优势。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，涉及一种点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP的dsRNA合成、dsRNA导入点蜂缘蝽体内以及该基因在防治点蜂缘蝽相关病虫害中的应用。

背景技术

点蜂缘蝽(Riptortus pedestris)是大豆田间常见的刺吸式害虫，主要通过其刺吸式口器持续刺吸植株和种子汁液来获取养分。点蜂缘蝽的持续取食会导致大豆植株的发育不良甚至死亡，且受到侵害的大豆种子也往往无法正常发育，最终导致大豆的减产。目前点蜂缘蝽的防控以化学农药为主，而传统农药的大面积使用不仅造成严重的环境问题，还使得点蜂缘蝽产生了抗药性，不利于农业的可持续发展。因此，开发新的点蜂缘蝽防治技术是解决当前化学农药滥用的良好途径。

RNA干扰技术是近年来生命科学研究的热点。它通过小分子双链RNA特异性地降解或抑制靶标基因mRNA表达，进而抑制或关闭特定基因。RNA干扰技术具有高特异性、高效率、便于操作等优点。目前，该技术已广泛应用于多种农业害虫的防控，即通过向昆虫体内导入特异的dsRNA，使得昆虫的特定功能丧失从而控制害虫的为害。近年来，已有研究人员借助RNA干扰技术以点蜂缘蝽为实验材料进行相关功能研究，例如：TOMOKO IKENO团队研究了生物钟基因Clock在Riptortus pedestris的昼夜节律中的作用和繁殖滞育的光周期调控(TOMOKO IKENO et al，2013),Jang团队发现Duox表达的气管特异性，通过RNAi干扰下调该基因导致其呼吸系统的崩溃(Seonghan Jang et al，2021)；然而，这些研究更多的是机理性研究，应用性不强，目前仍缺乏更有效、更环保的点蜂缘蝽病虫害防治技术；基于上述现有技术的缺陷，本专利发明人通过靶向对点蜂缘蝽生存必须的突触融合蛋白结合蛋白(syntaxin-binding protein，SDP)基因，建立点蜂缘蝽的RNA干扰系统以及点蜂缘蝽SDP(RpSDP)基因突变体；SDP广泛参与昆虫的囊泡运输和神经递质分泌，在昆虫神经递质传导过程中的发挥重要作用；发明人首次测定了点蜂缘蝽基因组(HUANG et al，2021)，本发明在此基础上鉴定了点蜂缘蝽的RpSDP基因，通过建立点蜂缘蝽的RNA干扰系统以及点蜂缘蝽RpSDP基因突变体，为点蜂缘蝽的防治提供序列和数据基础。

发明内容

本发明克隆点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP的部分序列，通过体外合成方法获得RpSDP基因的dsRNA，并将其导入点蜂缘蝽体内。沉默RpSDP基因能够显著降低点蜂缘蝽在大豆植株上的存活率，从而达到防控点蜂缘蝽的目的。

一方面，本发明涉及一种点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO:1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的核苷酸或由其组成；

另一方面，本发明一种点蜂缘蝽突触融合蛋白结合蛋白RpSDP基因,其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所编码的氨基酸或与SEQ ID NO:1编码的氨基酸具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸或由其组成；

另一方面，本发明还涉及一种RpSDP基因的克隆方法，步骤包括：

(1)取点蜂缘蝽若虫，Trizol法提取总RNA，并利用点蜂缘蝽总RNA为模板合成cDNA第一条链；

(2)以点蜂缘蝽cDNA为模板，以序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物和序列如SEQID NO.3所示的下游引物进行PCR扩增，得到含有的基因片段序列如SEQ ID NO:4所示的PCR扩增产物；