[发明专利]一种用于体外实验的蛋白提取方法

权利要求书

1.一种用于体外实验的蛋白提取方法，依次包括以下步骤：a)融合8HIS-MBP标签的蛋白表达载体的构建步骤；b)Rossta菌株热激转化步骤；c)Rosseta表达菌株培养、表达蛋白步骤；d)提取蛋白步骤；其特征在于：所述的d)提取蛋白步骤，依次包括以下步骤：

d1)收菌步骤：诱导表达结束后，4℃，4000rpm，离心15min，收集菌体；

d2)破碎步骤：加入适量的100mMNaCI，50mM Tris(PH＝7.4)的混合溶剂1于菌体中，形成菌液，将菌液置于超声破碎仪中，工作1s，间歇2s，破碎30min，得到破碎液；

d3)离心步骤：将破碎液于4℃，10000rpm，15min高速离心，得到离心上清；

d4)结合步骤：将离心上清加入镍珠(HIS珠)，混匀；4℃于旋转仪器中孵育2-24小时，使上清与镍珠充分结合，800rpm离心2min，弃上清保留镍珠，离心上清、镍珠的体积比为10：2-2.5；

d5)洗脱步骤：结合结束，先用少量混合溶剂1清洗镍珠，然后加入适量混合溶剂2进行洗脱，分2次收集洗脱液，第1个洗脱半程得到蛋白洗脱液1，第2次洗脱半程得到蛋白洗脱液2；

d6)层析步骤：将收集的蛋白洗脱液1、蛋白洗脱液2分别转移到层析过滤管，得到层析蛋白1、层析蛋白2；

d7)第1次浓缩步骤：将层析蛋白1、层析蛋白2；加入超滤离心管中，4℃，5000rpm，浓缩至原体积的3.3-7.1％，得到浓缩蛋白1、浓缩蛋白2；

d8)过分子筛步骤：先用超纯水将泵头、分子筛柱、上样环冲洗干净，再用蛋白质缓冲液清洗分子筛柱，用注射器将浓缩蛋白1、2通过上样孔注射上样，根据电脑工作站中蛋白吸收峰的出峰时间，用离心管分别收集各个峰对应的蛋白并做标记，将已经标记的蛋白取样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色、考马斯亮蓝洗脱液脱色，根据蛋白质的Mark值，确定目的蛋白对应收集管，将蛋白对应收集管中的蛋白液倒入超滤离心管中，4℃，5000rpm，浓缩至原体积的1-4％，得到浓缩蛋白21、浓缩蛋白22。

2.根据权利要求1所述的一种用于体外实验的蛋白提取方法，其特征在于：所述的混合溶剂1中100mMNaCI、50mM Tris(PH＝7.4)的体积比为2：5。

3.根据权利要求1所述的一种用于体外实验的蛋白提取方法，其特征在于：

所述的混合溶剂2中1M Tris(PH＝8.0)、5M NaCl、咪唑的摩尔比为1：3：5。

4.根据权利要求1所述的一种用于体外实验的蛋白提取方法，其特征在于：所述的蛋白质缓冲液中，每500ml溶液中含有1M Tris(PH＝8)25ml、5M NaCl 15ml，其余为超纯水。

5.根据权利要求1所述的一种用于体外实验的蛋白提取方法，其特征在于：

所述的a)融合8HIS-MBP标签的蛋白表达载体的构建步骤：

在snapgene软件上构建目的蛋白表达载体的质粒图谱，设计并合成引物，PCR扩增目的蛋白的蛋白编码序列，酚氯仿抽提纯化PCR产物，酶切、连接到含有8HIS-MBP标签的载体上，大肠杆菌热激转化，菌落PCR，质粒抽取、酶切、鉴定、测序；得到融合8HIS-MBP标签的蛋白表达载体。

6.根据权利要求1所述的一种用于体外实验的蛋白提取方法，其特征在于：

所述的c)Rosseta表达菌株培养、表达蛋白步骤：

取步骤b涂平板获得的目的蛋白表达菌株中的单克隆接入含有卡那霉素抗生素的LB液体培养基的试管中，37℃220rpm培养4-6h；

再摇菌液转接到含有卡那霉素抗生素的LB培养基的容器中，37℃220rpm培养6-8h；测量培养菌液OD值，OD值＝0.9-1时即可按2000：1的比例加入1M的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，16℃220rpm培养16-20h。