[发明专利]一种用于体外实验的蛋白提取方法

说明书

本发明公开了一种用于体外实验的蛋白提取方法，所述的提取方法依次包括以下步骤：a)融合8HIS‑MBP标签的蛋白表达载体的构建步骤；b)Rossta菌株热激转化步骤；c)Rosseta表达菌株培养、表达蛋白步骤；d)提取蛋白步骤；本发明与现有技术相比，所得蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯亮蓝染色、再脱色后观察，杂蛋白和断裂的蛋白明显的减少，蛋白的浓度达到32‑68mg/ml。

技术领域

本发明属于蛋白提取方法，特别属于体外下拉实验(pull-down)、凝胶阻滞实验(EMSA)、等温滴定(ITC)实验的蛋白提取方法。

背景技术

蛋白质是生物功能最直接的执行者，虽然一些蛋白质可以独立的完成他的使命，但是大部分的蛋白都是需要一些伴侣分子的协助一起完成任务或者形成复合物之后才能充分发挥他的功能。了解蛋白质与蛋白质之间的相互作用，能够帮助我们更好的了解细胞的生命活性，揭示隐藏在表象下的调控机理。经典的蛋白相互作分析研究实验包括Pull-Down，EMSA、ITC，这些试验通过蛋白相互作用来研究细胞通路。但这些实验在蛋白提取过程中存在着杂蛋白过多、提取的蛋白浓度低，只有1-2mg/ml。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于体外实验的提取蛋白浓度高，不小于30mg/ml的方法。

本发明解决技术问题的技术方案是：一种用于体外实验的蛋白提取方法，依次包括以下步骤：a)融合8HIS-MBP标签的蛋白表达载体的构建步骤；b)Rossta菌株热激转化步骤；c)Rosseta表达菌株培养、表达蛋白步骤；d)提取蛋白步骤；

所述的a)融合8HIS-MBP标签的蛋白表达载体的构建步骤：

在snapgene软件上构建目的蛋白表达载体的质粒图谱，设计并合成引物，PCR扩增目的蛋白的蛋白编码序列，酚氯仿抽提纯化PCR产物，酶切、连接到含有8HIS-MBP标签的载体上，大肠杆菌热激转化，菌落PCR，质粒抽取、酶切、鉴定、测序；得到融合8HIS-MBP标签的蛋白表达载体；

所述的；b)Rossta菌株热激转化步骤为：

转化方法同CN202110243351.5(一种定点突变的水稻隐色素及其构建方法)

所述的c)Rosseta表达菌株培养、表达蛋白步骤：

取步骤b涂平板获得的目的蛋白表达菌株中的单克隆接入含有卡那霉素抗生素的LB液体培养基的试管中，37℃220rpm培养4h-6h；再摇菌液转接到含有卡那霉素抗生素的LB培养基的容器中，37℃220rpm培养6h-8h；测量培养菌液OD值，OD值＝0.9-1时即可按2000：1的比例加入1M的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，16℃220rpm培养16-20h；

所述的d)提取蛋白步骤：

d1)收菌步骤：诱导表达结束后，4℃，4000rpm，离心15min，收集菌体；

d2)破碎步骤：加入适量的100mMNaCI，50mM Tris(PH＝7.4)的混合溶剂1于菌体中，形成菌液，将菌液置于超声破碎仪中，工作1s，间歇2s，破碎30min，得到破碎液；

所述的混合溶剂1中100mMNaCI、50mM Tris(PH＝7.4)是按照5M NaCl、1M Tris(PH＝7.4)体积比为2：5配制的；

d3)离心步骤：将破碎液于4℃，10000rpm，15min高速离心，得到离心上清；

d4)结合步骤：将离心上清加入镍珠(HIS珠)，混匀；4℃于旋转仪器中孵育2-24小时，使上清与镍珠充分结合，800rpm离心2min，弃上清保留镍珠，离心上清、镍珠的体积比为10：2-2.5；