[发明专利]肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法

权利要求书

1.一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建核心质粒：从含有目的基因的载体上扩增目的基因片段，酶切目的基因片段和质粒载体，将酶切后的目的基因片段和质粒载体连接，获得核心质粒；

制备肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株：将核心质粒导入293T细胞以使目的基因在293T细胞中表达，获得肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株；

所述目的基因为SOD1、TDP-43、FUS和C9orf72中的任一种。

2.如权利要求1所述的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，其特征在于，所述核心质粒为慢病毒核心质粒，构建慢病毒核心质粒的具体步骤为：将酶切后的目的基因片段和慢病毒核心质粒载体连接后通过受体扩增，获得慢病毒核心质粒。

3.如权利要求2所述的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，其特征在于，所述目的基因为SOD1，所述慢病毒核心质粒载体含有EGFP表达序列。

4.如权利要求1所述的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，其特征在于，在制备肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株步骤中，取慢病毒核心质粒、pSPAX2包装质粒和pMD2.G病毒包装质粒混合于转染培养基中，将含有慢病毒核心质粒、pSPAX2包装质粒和pMD2.G病毒包装质粒的转染培养基逐滴加入到293T感受态细胞培养液中并孵育，收集含有慢病毒的上清，再将含有慢病毒的上清与293T细胞孵育，获得肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株。

5.如权利要求4所述的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，其特征在于，所述慢病毒核心质粒、pSPAX2包装质粒和pMD2.G病毒包装质粒的质量之比为3:2:1。

6.如权利要求4所述的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，其特征在于，所述293T感受态细胞培养液采用以下方法制备：

将处于对数生长期的293T细胞用0.25％胰酶37度消化30～300s后，然用完全培养基收集293T细胞，培养至细胞汇合度为60％～90％，再将293T细胞置于含5％CO₂的37℃温箱中孵育至细胞贴壁完全后，去除原有培养基并加入Opti-MEM培养基，获得293T感受态细胞培养液。

7.如权利要求1所述的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，其特征在于，所述肌萎缩侧索硬化细胞模型的构建方法还包括抗生素筛选稳定株的步骤，具体为：

将肌萎缩侧索硬化细胞模型的培养基去除并添加含有嘌呤霉素的DMEM完全培养基，继续培养1～3周后的培养物为293T稳定株。

8.如权利要求7所述的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，其特征在于，所述含有嘌呤霉素的DMEM完全培养基中嘌呤霉素的浓度为1～10μg/mL。