[发明专利]肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法

说明书

本发明提供了一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，包括以下步骤：构建核心质粒：从含有目的基因的载体上扩增目的基因片段，酶切目的基因片段和质粒载体，将酶切后的目的基因片段和质粒载体连接，获得核心质粒；制备肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株：将核心质粒导入293T细胞以使目的基因在293T细胞中表达，获得肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株；所述目的基因为SOD1、TDP‑43、FUS和C9orf72中的任一种。本发明肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法能够构建长期稳定的ALS疾病细胞模型。

技术领域

本发明涉及细胞生物技术领域，具体涉及一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法。

背景技术

肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)，在美国被称为卢伽雷(Lou Gehrig)症。著名物理学家斯蒂芬·威廉·霍金21岁时罹患此症，在轮椅上生活长达半个世纪。该病极为罕见，人群中发病比例约为十万分之一，发病机制是上下运动神经元损伤导致的肌肉失能。患者晚期因呼吸肌和膈膜损伤导致呼吸衰竭而死亡。遗传分析揭示，约10％表现家族聚集发病，其余为散发病例，且该病好发于45-60岁的中老年人群。细胞水平研究表明，患者运动神经元内神经纤维聚集伴随线粒体功能异常，小胶质细胞被激活并促进星形胶质细胞活化，释放炎性因子和毒素。分子水平研究发现，运动神经元内自由基产生异常导致氧化压力升高，蛋白错误折叠和聚集加速，进而引发内质网应激反应。同时细胞膜上的谷氨酸转运体减少导致胞内的谷氨酸浓度上升，进而引起兴奋毒性。与此同时，细胞大量产生炎性因子，激活Caspase-3引发细胞凋亡。

研究表明，ALS的常见致病基因包括SOD1、TDP-43、FUS和C9orf72等，其中以SOD1(Superoxide Dismutase 1，超氧化物歧化酶)最为常见，是大约20％家族性ALS的致病基因。该基因编码一种超氧化物歧化酶，在神经元和胶质细胞中均广泛表达。现已发现上百种SOD1蛋白的突变体，均可导致SOD1蛋白折叠错误，在胞内产生大量聚集体。类似地，TDP-43、FUS和C9orf72编码的蛋白错误折叠也会导致ALS的发生。

目前美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准上市用于治疗ALS的药物为两种小分子。利鲁唑片(英文名：Riluzole)为苯并噻唑类抗谷氨酸药物，可以通透血脑屏障(Blood Brain Barrier,BBB)，抑制脑内神经递质(谷氨酸和天冬氨酸)的释放。依达拉奉(英文名：Radicava，edaravone)属于吡唑啉酮类化合物，可以清除胞内自由基，减轻氧化应激压力。利鲁唑只能延长患者生存周期约3个月，依达拉奉也只能改善患者的生活质量，无法根治此病。因此，有必要构建合适的ALS的细胞模型，模拟体内ALS的发病机制和运动神经元内SOD1存在和分布状态，为新药研发提供帮助。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，本发明还提供了一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法制备的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株，以解决现有肌萎缩侧索硬化细胞模型建模困难、影响因素繁多、造模效果差、成本高以及操作复杂等问题。

第一方面，本发明提供了一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，包括以下步骤：

构建核心质粒：从含有目的基因的载体上扩增目的基因片段，酶切目的基因片段和质粒载体，将酶切后的目的基因片段和质粒载体连接，获得核心质粒；

制备肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株：将核心质粒导入293T细胞以使目的基因在293T细胞中表达，获得肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株；

所述目的基因为SOD1、TDP-43、FUS和C9orf72中的任一种。