[发明专利]一种特异靶向LRRK2基因的sgRNA及其慢病毒转染载体和应用

说明书

本发明公开了一种一种特异靶向LRRK2基因的sgRNA及其慢病毒转染载体和应用。本发明针对LRRK2基因设计了3个不同的sgRNA寡核苷酸序列，构建了针对LRRK2靶基因的CRISPR/Cas9慢病毒表达载体，成功转染PC12细胞，获得能稳定传代的LRRK2基因缺陷的PC12细胞，为从分子水平和细胞水平探讨LRRK2基因在帕金森病中的调控作用提供了体外细胞模型，为进一步研究帕金森病发病机制、进展及治疗奠定了基础。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种特异靶向LRRK2基因的sgRNA及其慢病毒转染载体和应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一种常见的中枢神经系统变性疾病，临床主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓及姿势反射障碍四主征。随着社会人口的老龄化，PD患者正逐年增多，晚期患者多因严重运动障碍而导致生活自理能力丧失，给家庭和社会带来沉重的负担。

PD是遗传易患因素与环境因素共同作用的结果，而富含亮氨酸重复激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)与遗传及散发性帕金森病均有关，作为联系这两大因素的核心和共同通路，通过氧化应激、加速α-突触核蛋白(α-synuclein)的聚集、线粒体功能紊乱等多种途径介导DA(多巴胺)能神经元变性，均提示LRRK2在PD的发病机制中发挥重要的作用。多项临床研究表明，LRRK2基因突变与帕金森病发病密切相关。在动物实验中应用原位杂交技术也发现患帕金森病的成年鼠基底节区LRRK2表达水平较高。由此抑制LRRK2生成可作为PD神经保护治疗的一种可行性措施。

近年来，利用成簇规律间隔的短回文重复序列(The clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，CRISPR)技术在体外和体内编辑多种细胞类型和生物体中的单个或多个基因，已然成为当今生物医学领域的热门技术。CRISPR/Cas是细菌为抵御外来DNA入侵所进化出的一种适应性免疫防御机制，通过RNA介导的Cas核酸酶能够特异性的识别和切割入侵的外来核酸。

近年来，基因编辑技术包括锌指核糖核酸酶(ZEN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9等。然而，第1代锌指核糖核酸酶和第2代转录激活样效应因子核酸酶过程相对繁琐，敲除往往不完整且持续时间有限。作为第3代基因组编辑工具，CRISPR/Cas9系统由sgRNA识别靶位点，具有成本低、过程简便、高效等优势，由此越来越多的应用于细胞的基因组编辑。

迄今为止，PD尚缺乏长期有效的治疗手段，现行的各种治疗方法均不能有效阻止PD病理过程中LRRK2突变对DA神经细胞的毒性作用，从而陷入困境，而CRISPR/Cas9基因编辑技术能够在基因组水平上特异性敲除目的基因，是研究基因功能的强而有力手段。

发明内容

本发明的目的在于为了克服现有技术中的缺点和不足，提供一种特异靶向LRRK2基因的sgRNA及其慢病毒转染载体和应用。所述的sgRNA可通过CRISPR/Cas9基因编辑技术造成LRRK2基因的DNA缺失，从而高效实现对LRRK2基因的特异性敲除，并且得到稳定敲除LRRK2基因的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株，从根本上解决LRRK2突变对DA神经细胞的毒性作用，从而保护多巴胺能神经元，促进多巴胺能神经元的再生和修复，从而为PD的治疗提供新的策略。

本发明的第一个目的是提供一种特异靶向LRRK2基因的sgRNA核苷酸序列。所述的sgRNA核苷酸选自下列中的至少一种：

(1)、Lrrk2-sgRNA-1：5’-GCACACTGGCGACTCTCATGT-3’，如SEQ ID NO：1所示；

(2)、Lrrk2-sgRNA-2：5’-GCGCCTGTCAGGGCTGCGACG-3’，如SEQ ID NO：2所示；