[发明专利]一种针对表皮生长因子受体双特异性抗体的Protein A纯化保存方法

说明书

本发明公开了一种针对表皮生长因子受体双特异性抗体的Protein A纯化保存方法，以Protein A为亲和填料，用蛋白洗脱液洗脱表皮生长因子受体双特异性抗体，将纯化后的双特异性抗体换液保存于蛋白贮存液中，并具体公开了蛋白洗脱液以及蛋白贮存液的成分。本发明针对表皮生长因子受体双特异性抗体aEGFR‑aPDL1 BsAb的洗脱液和贮存液进行了优化，找到了一类稳定的缓冲液组成成分，显著提高了蛋白回收率和纯度。

技术领域

本发明涉及抗体分离纯化领域，尤其涉及一种针对表皮生长因子受体双特异性抗体的Protein A纯化保存方法。

背景技术

PD-L1称为程序性死亡受体配体-1，参与免疫逃逸，能够与PD-1结合，抑制T细胞增殖以及细胞因子分泌，负调控淋巴细胞的激活。PD-1的全称是程序性死亡受体-1，属于CD28超家族成员，是由268个氨基酸组成的I型跨膜蛋白，可在T细胞、B细胞等免疫细胞表面表达。不过在T细胞未活化时，几乎不表达PD-1，仅在T细胞活化之后，PD-1才在T细胞表面表达。如前所述，PD-1可与PD-L1结合，二者互为受体与配体。正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性T细胞(CD8+Tcell增生)。而细胞程序性死亡受体-1(PD-1)与细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结CD8+T细胞的增生。aPD-L1是一种单克隆抗体，可与PD-L1结合并阻断其与PD-1受体的相互作用。这释放PD-L1/PD-1介导的免疫应答抑制，包括激活抗肿瘤免疫应答而不诱导抗体依赖性细胞毒性。在同系小鼠肿瘤模型中，阻断PD-L1活性导致肿瘤生长减少。

EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体。研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，包括头颈癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌以及非小细胞肺癌等，尤其是肺癌，亚裔肺癌人群中EGFR突变率可达到50％。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。EGFR是肿瘤临床治疗中的一个重要的靶点。

双特异性抗体(bispecific monoclonal antibody,BsAb)是一种人工制作出来的可以同时结合两种不同抗原的特殊抗体。研究双特异性抗体，对于癌症的免疫治疗有着重大的意义，目前已经发展为肿瘤临床的治疗的一大热点。双特异性抗体相比单抗的优势主要在于可介导时序或空间效应，但技术门槛和研发成本较高，构建阶段可能会遇到表达量低、稳定性差的问题。

Protein A是一种从金黄色葡萄球菌中分离出来的细菌细胞壁蛋白，主要通过Fc区域与哺乳动物的IgG结合。Protein A有五个IgG结合结构域。在抗体相关蛋白的纯化过程中，首选Protein A resin作为抗体捕获的亲和层析介质。通常情况下，抗体或者含有Fc区域的融合蛋白在中性条件下与Protein A结合，在酸性条件下进行蛋白洗脱。绝大多是单克隆抗体采用pH2.5-pH3.0的0.1mol/L甘氨酸洗脱溶液，在该条件下，单克隆抗体具有较高的纯度和回收率。但是对于一些性质不稳定双特异性抗体，如由表皮生长因子受体抗体和细胞程序性死亡-配体1抗体融合而成的表皮生长因子受体双特异性抗体，使用上述溶液进行蛋白洗脱后，蛋白容易产生沉淀，从而导致蛋白的回收率和纯度下降。因此，仍然需要寻找一种能够使蛋白稳定的表皮生长因子受体双特异性抗体的纯化方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明公开了一种针对表皮生长因子受体双特异性抗体的Protein A纯化保存方法，对蛋白贮存液进行了改进，解决了蛋白回收率低以及贮存过程中蛋白不稳定的问题。

本发明公开了一种针对表皮生长因子受体双特异性抗体的Protein A纯化保存方法，以Protein A为亲和填料，用蛋白洗脱液洗脱表皮生长因子受体双特异性抗体，将纯化后的表皮生长因子受体双特异性抗体换液保存于蛋白贮存液中，

蛋白洗脱液的组成为：