[发明专利]双水相萃取植物乳杆菌发酵液中活性多肽及其制备方法

说明书

本发明属于生物活性肽的提取技术领域，具体公开了一种双水相萃取植物乳杆菌发酵液中活性多肽及其制备方法，具体包括：植物乳杆菌发酵培养，将发酵液离心得到上清液；采用无水乙醇和硫酸铵配制双水相萃取体系；将发酵上清液加入到所获得的双水相萃取体系中进行萃取，静置分液成两相后，收集上相萃取液；向收集的上相萃取液中加入其体积2.5倍的无水乙醇，析出无机盐后，离心分离得到纯化的上清液；将纯化上清液使用旋转蒸发仪干燥浓缩后，得到活性多肽。本发明与传统分离手段相比，避免了挥发性有机溶剂的使用，整个过程无毒无害，提取的活性多肽具有更高抑菌活性，提取产品可用于食品和药品生产，能带来巨大的社会效益和经济效益。

技术领域

本发明涉及生物活性肽的提取技术领域，特别是一种双水相萃取植物乳杆菌发酵液中活性多肽及其制备方法。

背景技术

当今世界，随着科技进步，经济的快速发展，人民生活水平的提高，对卫生健康及药品医疗提出了更高的要求。应用于食品行业中的化学防腐剂效果虽好，但是越来越多的研究报道反映出其越来越多的副作用，其安全性受到各方面的质疑。因此，我们需要开发出一种新的安全无毒生物防腐剂，以应对人们对卫生安全提出更高更严格的要求。

研究已证明，由植物乳杆菌发酵所产生的多肽类活性物质(即植物乳杆菌素，一种细菌素)对生产、生活中常见的致病菌具有较高的抗性作用。近几年相关研究已发现，植物乳杆菌素具有抑菌谱广、抗逆性强、不易产生抗性、几乎没有副作用等优点，尤其它的抗菌谱比由乳酸链球菌产生的细菌素Nisin更为广泛。Nisin是目前被美国食品药品监督管理局(FDA)批准的唯一一个用于食品防腐剂的细菌素，目前已广泛应用于食品加工领域。但Nisin只能抑制食品中革兰氏阳性菌的生长，对革兰氏阴性菌基本无影响，而植物乳杆菌素无论是对革兰氏阳性菌、还是对革兰氏阴性菌，其抑菌活性都非常强。但是作为发酵产物，植物乳杆菌素的提取难度相对较大，产率较低。因此，目前除了细菌素Nisin被规模化提取出来，其它仍旧停留在实验研究阶段。

目前研究中常用的细菌素提取方法为有机物萃取、分子筛柱层析、AKTA离子交换层析等。使用这些方法虽然能分离出来部分细菌素，但是整体过程耗时长、操作复杂、成本高，而且涉及到多种有机溶剂的使用。因此，这些方法仅适合于实验室提取分离，但无法应用于工业化规模生产。所以，如何能将植物乳杆菌发酵生产的活性多肽物质简便、快速地提取出来，这是影响其能否真正应用到实际生产中的关键技术因素。

双水相体系是指将两种水溶性物质混合后，在一定比例下出现自发分离成互不相溶的两相体系。利用目标物质在两相之间的选择性分配实现分离，因目标物质的物理性质及环境因素，其在上下两相中的分布不同，从而进行萃取。在萃取过程中，分子间氢键、盐析作用、电荷相互作用、范德华力、聚合现象、疏水作用、界面性质作用等都发挥重要作用。较之传统萃取方法，双水相萃取条件温和，不易引起蛋白质的变性失活，避免有机溶剂残留的问题。而且双水相萃取具有较高的生物相溶性，对设备要求较低，操作简单，易于放大生产。因此，双水相萃取作为一种新型的分离提取方法在多个领域发挥着重要作用，其对物质的组分分离与富集有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种有效、安全的提取方法，提高其生产效率，降低生产操作难度，减少时间和成本的消耗的双水相萃取植物乳杆菌发酵液中活性多肽及其制备方法。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

本发明的第一个目的是要提供一种双水相萃取植物乳杆菌发酵液中活性多肽的方法，包括以下步骤：

S1、植物乳杆菌发酵培养，将发酵液离心得到上清液；

S2、采用无水乙醇和硫酸铵配制双水相萃取体系，其中双水相萃取体系中无水乙醇的体积浓度为32-36％，硫酸铵的质量体积比为20-24％；

S3、将上述步骤S1获得的发酵上清液加入到步骤S2获得的双水相萃取体系中进行萃取，静置分液成两相后，收集上相萃取液；