[发明专利]活细胞膜整合素αv

说明书

本发明涉及一种活细胞膜整合素αsubgt;v/subgt;βsubgt;3/subgt;聚糖的原位糖链延长方法。通过偶联αsubgt;v/subgt;βsubgt;3/subgt;的特异性识别多肽(Pep)和半乳糖氧化酶(GAO)，构建聚糖重构探针Pep‑GAO。在Ksubgt;4/subgt;[Fe(CN)subgt;6/subgt;]存在下，酶活性被抑制的Pep‑GAO可以结合活细胞表面的整合素αsubgt;v/subgt;βsubgt;3/subgt;，然后加入Ksubgt;3/subgt;[Fe(CN)subgt;6/subgt;]激活GAO，使其氧化αsubgt;v/subgt;βsubgt;3/subgt;糖链末端的半乳糖或N‑乙酰半乳糖胺，生成可以发生生物正交反应的醛基。该基团可与酰肼功能化的糖分子发生连接反应，生成腙键，从而实现αsubgt;v/subgt;βsubgt;3/subgt;上糖链的延长。该方法在活细胞水平上实现了对特定蛋白聚糖结构的编辑，为细胞膜蛋白聚糖的功能研究和活体聚糖调控提供了有力的工具。

一、技术领域

本发明介绍了一种活细胞膜整合素α_vβ₃聚糖的原位糖链延长方法。该方法通过构建特异性识别α_vβ₃的聚糖重构探针，氧化活细胞表面α_vβ₃糖链的末端聚糖生成醛基，进一步与酰肼修饰糖分子反应，实现细胞膜α_vβ₃聚糖的糖链延长。

二、背景技术

糖基化是普遍存在于真核生物中的蛋白质翻译后修饰模式。细胞表面的聚糖参与了一系列重要的生物过程。异常的糖基化与多种疾病的发生和发展密切相关，因此对活细胞表面特定蛋白的聚糖结构进行编辑，是一种重要的疾病干预手段，已被用于增强赫赛汀对乳腺癌的治疗效果。

整合素α_vβ₃是细胞膜表面由α亚基(CD51)和β3亚基(CD61)形成的跨膜异源二聚体糖蛋白。α_vβ₃介导细胞与细胞外基质间的双向信号传递，是一个高度糖基化的蛋白。α_vβ₃的聚糖结构与细胞存活、迁移、侵袭等细胞行为密切相关，被认为是有潜力的KRAS突变相关肿瘤的治疗靶标。然而目前尚无在活细胞水平特异性编辑α_vβ₃糖链的方法。

本发明结合可以特异性识别α_vβ₃的多肽和可以在细胞外部特异性氧化糖链末端半乳糖/N-乙酰半乳糖胺(Gal/GalNAc)的半乳糖氧化酶(GAO)，构建活细胞聚糖重构探针，通过对探针的酶活性进行程序性抑制-激活，特异性氧化活细胞表面整合素α_vβ₃的末端Gal/GalNAc生成醛基，进一步与酰肼修饰的糖分子发生连接反应，实现α_vβ₃糖链的延长。该方法无需进行基因操作，从活细胞外部简单快捷地编辑糖链结构，为在活细胞上原位研究特定蛋白上聚糖的生物学功能提供了工具，对于发展聚糖干预技术用于疾病治疗具有重要意义。

三、发明内容

本发明的内容是：构建特定蛋白的聚糖重构探针，在活细胞表面原位靶向整合素α_vβ₃后特异性氧化其糖链末端的Gal/GalNAc，生成可以发生生物正交反应的醛基。进而利用醛基与酰肼修饰糖分子的偶联反应实现α_vβ₃上聚糖的糖链延长。

该方法首先以琥珀酰亚胺酯和马来酰亚胺双修饰的聚乙二醇1000(NHS-PEGl000-MAL)作为连接分子，偶联巯基修饰的c(RGDfK)多肽(Pep)和GAO的氨基，制备聚糖重构探针Pep-GAO，如图1所示。