[发明专利]基于CRISPR-Cas触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统及其应用和方法

权利要求书

1.基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，其特征在于：包括含茎环结构的单链RNA、环形的单链核酸、具有反式切割活性的Cas酶、RCA反应试剂和G-四链体/hemin DNAzyme催化ABTS显色体系；

所述单链RNA与待检双链DNA靶标中的一条链部分同源且能与另一条链互补结合，所述单链RNA能与Cas酶结合形成复合体，所述复合体在待检靶标存在下附属切割活性被激活；

所述环形的单链核酸能与RCA引物结合并扩增，且扩增产物能产生G-四链体的序列，还具有Cas酶附属切割位点序列；

所述G-四链体/hemin DNAzyme催化ABTS显色体系由hemin溶液、含K⁺的缓冲液、H₂O₂溶液和ABTS缓冲液构成，所述扩增产物在含K⁺和hemin溶液中形成G-四链体/hemin DNAzyme复合物，所述G-四链体/hemin DNAzyme复合物与H₂O₂溶液和ABTS缓冲液发生颜色反应。

2.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，其特征在于：所述单链RNA的浓度为15～35nmol/L；所述Cas酶浓度为15～30nmol/L；所述phi29 DNA聚合酶含量为0.1～2U；所述含K⁺的缓冲液的pH为4～8。

3.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，其特征在于：所述G-四链体/hemin DNAzyme催化ABTS显色体系中hemin溶液为10μmol/Lhemin；所述含K⁺的缓冲液各组分如下：50mmol/L HEPES，400mmol/L NaCl，40mmol/L KCl，0.1％Triton X-100，2％DMSO，pH 7.0；所述H₂O₂溶液为40mmol/L H₂O₂；所述ABTS缓冲液由pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解ABTS至浓度为7.5mmol/L。

4.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，其特征在于：所述RCA反应体系含有RCA引物、phi29 DNA聚合酶、dNTPs以及1×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液。

5.根据权利要求1所述基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，其特征在于：所述待检靶标为EGFR 19del，所述单链RNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述环形的单链核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.根据权利要求4所述基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，其特征在于：所述RCA引物为如SEQ ID NO.5所示。

7.权利要求1～6任一项所述可视化检测系统在检测待检靶标试剂中的应用。