[发明专利]基于CRISPR-Cas触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统及其应用和方法

说明书

本发明公开了基于CRISPR‑Cas触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统及其应用和方法，通过采用CRISPR‑Cas、RCA、G‑四链体/hemin DNAzymes信号放大技术检测待测基因，能够实现敏感特异、低成本、无需大型实验设备、简单裸眼判读检测结果，检测灵敏度高，最低检测限低至20fmol/L；检测过程中Cas/crRNA复合物可直接识别血清中的靶标，不需核酸提取步骤；采用恒温扩增，无需精密温控设备，检测方法简单、易于操作、敏感特异、低成本、设备简单、通用性好、准确度高。

技术领域

本发明涉及医学检测领域，具体涉及基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，还涉及该系统的应用和方法。

背景技术

表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)是HER/ERBB酪氨酸激酶受体家族的一员，在细胞增殖、分化、迁移和凋亡等多种细胞信号通路中发挥重要作用。研究显示，EGFR在非小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、结直肠癌、头颈部癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤中均高表达。在所有EGFR激酶结构域突变体中，大约47.0％为第19号外显子15bp的框内缺失(EGFR 19del)突变。已经证明，携带EGFR 19del突变的患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)表现出高度敏感性。因此，EGFR 19del基因突变已成为预测EGFR-TKIs治疗非小细胞肺癌敏感性的一个非常重要的生物标志物。

目前，用于EGFR 19del检测的主要方法有下一代测序(NGS)、液滴数字聚合酶链反应(ddPCR)以及突变扩增阻滞系统-聚合酶链反应(ARMS-PCR)等方法。然而，这些方法存在操作繁琐、成本高、依赖热循环仪等缺点，限制了其在资源贫乏地区的广泛应用。最近，电化学传感技术和石英晶体微天平(QCM)等生物传感技术也被开发用于EGFR 19del检测。然而，这些方法往往涉及多次清洗步骤，依赖DNA化学修饰，需要专门的检测仪器来获取输出信号。因此，开发一种低成本、简单的基于肉眼的EGFR 19del比色生物传感器是非常必要和关键的。

CRISPR/Cas是细菌和古细菌的一种适应性免疫应答系统，保护自身免受病毒和质粒的入侵。在过去的几年中，该系统作为一种强大的基因编辑工具，广泛用于分子免疫、基因工程以及转录调控。近期研究发现，Cas12、Cas13和Cas14效应子在识别和切割特定靶标后表现出强大的反式切割活性，这揭示了CRISPR-Cas在核酸检测中的巨大潜力。现有的CRISPR-Cas生物传感平台大多需要与PCR、环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等预扩增方法相结合，以实现靶标的超敏检测。但是，这些预扩增技术大多存在难以处理且不可避免的非特异性扩增。此外，尽管这些基于CRISPR的生物传感平台在分子诊断方面取得了革命性的突破，但几乎所有这些技术都需要庞大而昂贵的荧光设备、样品处理繁琐，以及不能定量分析，这些缺点限制了它们在现场快速检测中的应用。

RCA具有简单、灵敏、高效等优点，广泛应用于DNA、RNA、DNA甲基化、蛋白质和癌细胞等的检测。现有RCA检测技术大多以靶标核酸为模板，通过碱基互补配对原则将线性DNA挂锁连接为环状DNA模板，由于样本中含有与靶标核酸序列相近的核酸片段，因此容易产生不纯的环状DNA模板，从而导致非特异性RCA反应。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas12a触发无非特异滚环扩增的可视化检测系统，采用CRISPR-Cas系统诱导环形单链DNA裂解，从而消除RCA的非特异性扩增反应，构建一种免标记和免洗的EGFR 19del可视化检测平台；本发明的目的之二在于提供所述可视化检测系统在检测待检靶标中的应用；本发明的目的之三在于提供利用所述可视化检测系统检测待测靶标的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：