[发明专利]全雄无黑色素红罗非鱼的生产方法

权利要求书

1.一种全雄无黑色素红罗非鱼的生产方法，包括下述步骤：

S1：将红罗非鱼雌鱼XX与雄鱼XY的一部分交配后代进行雌性化处理，获得并筛选出遗传基因型为XY的转化雌鱼；

S2：将红罗非鱼雌鱼XX与雄鱼XY的另一部分交配后代进行基因编辑，获得并筛选出XY雄性tyrb F0代嵌合突变体；

S3：将步骤S1的XY的转化雌鱼和步骤S2的XY雄性tyrb F0代嵌合突变体交配；一部分交配后代不处理，获得并筛选出遗传基因型为tyrb^+/-XY的雄鱼和tyrb^+/-YY的超雄鱼；另一部分交配后代进行雌性化处理，获得并筛选出遗传基因型为YY的tyrb^+/-的转化雌鱼和遗传基因型为XX的tyrb^+/-雌鱼；

S4：将步骤S3的tyrb^+/-YY超雄鱼与tyrb^+/-YY转化雌鱼交配；一部分交配后代不处理，获得并筛选出tyrb^-/-YY超雄鱼；另一部分后代进行雌性化处理，获得并筛选出tyrb^-/-YY转化雌鱼；

S5：将步骤S3的tyrb^+/-XY雄鱼与tyrb^+/-XX雌鱼交配，筛选并获得tyrb^-/-XX雌鱼；

S6：将步骤S4的tyrb^-/-YY超雄鱼与步骤S5的tyrb^-/-XX雌鱼交配，获得全为tyrb^-/-XY无黑斑GMT红罗非鱼；

S7：将步骤S4的tyrb^-/-YY超雄鱼与tyrb^-/-YY转化雌鱼交配生产全tyrb^-/-YY超雄鱼，建立tyrb^-/-YY维持系；

其中，步骤S4和S5不分先后；步骤S7在步骤S4之后的任一步骤顺序。

2.根据权利要求1所述的全雄无黑色素红罗非鱼的生产方法，其特征在于，所述步骤S1中，雌性化处理方法为，将胚胎发育至孵化后5天或受精后10天开始用含17β-雌二醇200μg/g饲料处理30天获得XY转化雌鱼。

3.根据权利要求1所述的全雄无黑色素红罗非鱼的生产方法，其特征在于，所述步骤S2中，XY雄性tyrb F0代嵌合突变体的获得方法为，将300ng/μl tyrb的gRNA和1000ng/μlCas9 mRNA等体积同时注射到红罗非鱼雌鱼XX与雄鱼XY交配获得的发育到I细胞期受精卵，饲养至90天。

4.根据权利要求1所述的全雄无黑色素红罗非鱼的生产方法，其特征在于，所述步骤S3或S4中，雌性化处理方法为，将受精后10天或孵化后5天的幼鱼开口时开始投喂同时添加雌激素和雄激素的抑制剂的饲料进行处理至2个月，雌激素为17β-雌二醇，200μg/g饲料，雄激素的抑制剂为雄激素合成酶3β-HSD抑制剂，200μg/g饲料。

5.根据权利要求1所述的全雄无黑色素红罗非鱼的生产方法，其特征在于，所述步骤S3或S4中，还包括下述步骤：筛选出的tyrb^+/-YY转化雌鱼或tyrb^-/-YY转化雌鱼，用含低剂量雌激素和雄激素的抑制剂的饲料从6月龄处理至7月龄，然后进行正常饲养到性成熟，获得可育的tyrb^+/-YY转化雌鱼或可育的tyrb^-/-YY转化雌鱼，所述低剂量为17β-雌二醇，50μg/g饲料，雄激素合成酶3β-HSD抑制剂，50μg/g饲料。

6.根据权利要求1所述的全雄无黑色素红罗非鱼的生产方法，其特征在于，所述步骤S1-S5中，采用Marker1筛选鉴定罗非鱼的遗传基因型性别，其中，Marker1为X染色体中包含SEQ ID NO：1的一段基因序列和Y染色体中包含SEQ ID NO：2的一段基因序列。