[发明专利]全雄无黑色素红罗非鱼的生产方法

说明书

本发明开发了稳定的红罗非鱼性别特异分子标记，并将性别特异分子标记应用于红罗非鱼XY和YY转化雌鱼的筛选和YY维持系的建立，使得红罗非鱼GMT的推广应用成为可能。进而提供了一种全雄无黑色素红罗非鱼的生产方法，将CRISPR/Cas9基因编辑技术与MAS‑GMT技术相结合，即通过白化基因tyrb的纯合突变消除红罗非鱼的黑斑，同时在突变体中通过激素诱导和分子标记辅助选择建立红罗非鱼tyrb^‑/‑YY维持系，获得tyrb^‑/‑XX个体，通过tyrb^‑/‑XX雌鱼和tyrb^‑/‑YY超雄鱼交配，规模化生产体色均一无黑斑的GMT红罗非鱼鱼苗，显著提高养殖产量和效益、降低养殖成本、减少激素的使用。

技术领域

本发明涉及红罗非鱼遗传改良和育种技术，具体涉及一种高效生产无黑斑的遗传全雄红罗非鱼的方法。

背景技术

罗非鱼又称非洲鲫鱼，是世界性的养殖鱼类，也是联合国粮农组织推荐的重要水产养殖品种之一，中国是世界上最大的罗非鱼养殖国和出口国，2020年的养殖产量达180万吨。红罗非鱼是莫桑比克罗非鱼红橙色突变体与尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、荷那龙罗非鱼杂交产生的不同杂交品系的统称，又称彩虹鲷，具有肉质好、体色鲜艳、无黑色腹膜、繁殖力强、生长快、食性广、饲料要求低、耐低氧、适应性和抗病力强等优点。由于红罗非鱼体色鲜红形似海洋鱼类，可媲美观赏鱼而受到广大消费者的青睐且市场价格高于黑罗非鱼。目前，红罗非鱼已成我国罗非鱼养殖的重要品系。

红罗非鱼性周期短，繁殖快，雄性比雌性生长快50％。为了避免养殖中红罗非鱼过早过度繁殖，获得生长快、个体大、规格整齐、产量高的商品鱼，需要进行单雄性红罗非鱼生产。目前生产上采用雄激素诱导雌性罗非鱼性反转，从而获得全雄红罗非鱼。尽管该方法简便易行，被广泛的应用于养殖场，但激素对人体的免疫系统和养殖水域的生态环境有很大的危害，不符合无公害健康养殖的要求。遗传雄性罗非鱼技术(Genetically MaleTilapia,GMT)又称三系配套法，是生产绿色无公害全雄罗非鱼的首选方法，然而目前在红罗非鱼中尚未有GMT的报道。红罗非鱼为XX/XY的性别决定系统，理论上其YY超雄鱼与XX雌鱼交配后代雄性率为100％。GMT生产全雄红罗非鱼的技术路线如下：将杂交和性反转方法相结合，三系是指原系(XX♀，XY♂)、转化系(XY♀，YY♀)和雄性纯合系(YY♂)，将三者配套来生产GMT红罗非鱼。具体方法如下：将性别未分化的鱼苗进行雌性化处理，用红罗非鱼性别特异分子标记筛选鉴定转化雌鱼(XY♀)；将转化雌鱼(XY♀)与原系雄鱼(XY♂)交配，一半后代进行雌性化处理，另一半不处理，用红罗非鱼性别特异分子标记筛选鉴定YY超雄鱼和YY转化雌鱼；将YY转化雌鱼与YY超雄鱼交配，获得全YY超雄鱼，建立红罗非鱼YY维持系；将YY超雄鱼与原系雌鱼(XX♀)交配，生产遗传全雄红罗非鱼。GMT是生产全雄红罗非鱼最理想、最科学的方法。然而，由于缺乏能够准确、快速鉴定红罗非鱼遗传性别的性别特异标记(标记辅助选择：Marker-assisted selection,MAS)，严重制约了红罗非鱼GMT推广应用。

另一方面，红罗非鱼因其体色艳丽比黑罗非鱼更受消费者青睐。然而，红罗非鱼繁殖过程中不可避免会产生体色分离，每一代都会产生大量不受消费者欢迎的带黑斑个体，尤其在低温越冬后黑斑更明显。消费者通常误认为带黑斑的红罗非鱼是养殖或运输过程中由于疾病或损伤造成的，导致黑斑个体市场售价远低于红色几乎无黑斑的个体，价格差别甚至达到两倍之巨。因此，培育稳定遗传的无体色分离无黑斑的纯红罗非鱼新品系是提高红罗非鱼养殖规模和生产效益的重要前提。

获得纯红罗非鱼的传统方法有两个：一是持续选择纯红体色的罗非鱼作为亲鱼，但由于手工选出的纯红亲本可能是杂合子，繁殖的后代会产生不同比例的带黑斑个体；二是选出纯红色表型的亲鱼与黑色的鱼进行测交，统计后代表型比例，筛选出红色纯合子作为亲鱼；但这样做耗时耗力、效益低下，工作量大不能进行规模化生产。同时长期近亲繁殖又必然导致种质衰退，不利于育种。这两种传统方法都不能满足规模化生产的需求。