[发明专利]一种蓝氏贾第虫LAMP快速检测方法

权利要求书

1.一种蓝氏贾第虫LAMP快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、根据NCBI中已有的蓝氏贾第虫序列，通过序列比对，多次试验的方法，筛选到可以用于蓝氏贾第虫LAMP的序列，用软件设计蓝氏贾第虫LAMP引物3组，筛选到最佳引物1组，合成蓝氏贾第虫巢氏PCR引物2对；

步骤二、按照LAMP检测试剂盒扩增反应体系，对反应体系进行优化，通过调整引物、MgCl₂、ThermoPol reaction buffer、dNTP mixture、DNA模板和Bst DNA聚合酶的浓度，确定LAMP反应的最佳反应体系；

步骤三、以蓝氏贾第虫、隐孢子虫、阿米巴原虫、芽囊原虫和弓形虫阳性样品基因组DNA作为模板，以超纯水为阴性对照，加入LAMP反应管中进行特异性试验；

步骤四、向反应管中加入1μL 1000×SYBR Green I，在自然光下用肉眼观察，呈现绿色判定为阳性，保持棕色不变判定为阴性；

步骤五、将蓝氏贾第虫阳性样本的总DNA进行倍比稀释后作为模板，分别用优化后的LAMP反应体系和巢氏PCR进行检测，进行引物敏感性试验；

步骤六、采集新鲜犊牛粪便样本，提取DNA，于-20℃环境下保存备用；

步骤七、分别用优化后的LAMP反应体系和巢氏PCR进行步骤六提取的DNA检测，比较两种方法检测蓝氏贾第虫的阳性率是否具有差异。

2.根据权利要求1所述的一种蓝氏贾第虫LAMP快速检测方法，其特征在于：提取待检样品的DNA是按照粪便基因组DNA提取试剂盒提取待检样品的DNA。

3.根据权利要求1所述的一种蓝氏贾第虫LAMP快速检测方法，其特征在于：3组引物的序列分别为：

第1组：

F3 ATGGACGACGGCCAGG B3 CCCTCGTACCAGGGCATC

FIP AGCCGATGTTCTTGAGCTGCTT-GTACTCGAAGGAGCGCTACG

BIP GGAAGAAGGCCGAGGAGTTCG-TTGTCGGACCTCTCCATGA

LF TCATCTCGCCCTTGATCTCG

LB CTGGACCGGGGACAACA；

第2组：

F3 ACTCGAAGGAGCGCTACG B3 GCGTCGATCAGGCACG

FIP CTCGGCCTTCTTCCAGCCG-ACGAGATCAAGGGCGAGATG

BIP TTCGACTACATCCCGACGTCCG-CCTCGTACCAGGGCATCT

LB GGGACAACATCATGGAGAGGT；

第3组：

F3 GCCGGGATCTCGAAGGAC B3 TCGGGATGTAGTCGAACTCC

FIP TGACCTGGCCGTCGTCCATCTT-GCGACGCTCGCGAACA

BIP GTACTCGAAGGAGCGCTACGAC-GCCTTCTTCCAGCCGATG

LF ATCGTCTTGATCCCGAGCG

LB CAAGGGCGAGATGATGAAGCA；

其中，第2组为最佳引物组。

4.根据权利要求1所述的一种蓝氏贾第虫LAMP快速检测方法，其特征在于：巢氏PCR引物序列为：

G7F AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC

G7R GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC

Giar F GAACGAACGAGATCGAGGTCCG

Giar R CTCGACGAGCTTCGTGTT。