[发明专利]一种蓝氏贾第虫LAMP快速检测方法

说明书

本发明公开了一种蓝氏贾第虫LAMP快速检测方法，属于生物技术领域。一种蓝氏贾第虫LAMP快速检测方法，包括以下步骤：根据NCBI中已有的蓝氏贾第虫序列，通过序列比对，多次试验的方法，筛选到可以用于蓝氏贾贾第虫LAMP的序列并设计LAMP引物；以蓝氏贾第虫、隐孢子虫、阿米巴原虫、芽囊原虫和弓形虫阳性样品基因组DNA作为模板进行引物的特异性试验，以超纯水为阴性对照，向反应管中加入1μL 1000×SYBR Green I，在自然光下用肉眼观察，同时用巢氏PCR进行验证；将蓝氏贾第虫阳性样本的总DNA进行倍比稀释后作为模板，分别用优化后的LAMP反应体系和巢氏PCR进行检测，进行引物的敏感性试验；采集新鲜犊牛粪便样本，提取DNA，分别用优化后的LAMP反应体系和巢氏PCR进行比较。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及一种蓝氏贾第虫LAMP快速检测方法。

背景技术

蓝氏贾第虫是一种重要的机会性人兽共患肠道原虫，与人体健康和畜牧业发展联系紧密，随着养殖规模的不断扩大，该病的关注度越来越高。

犊牛感染该虫后，常出现腹泻、食欲减退、消瘦等症状，粪便中带有血液、粘液，严重会导致犊牛的死亡，该病已经造成了巨大的经济损失，并呈范围扩大趋势，因而引起国内外学者的广泛关注。

传统关于对造成犊牛腹泻的寄生虫检测方法通常为粪便样品的显微镜检查法，但传统的检测方法仍然存在耗时较长、检出率低等缺陷。随着免疫学和现代分子生物学的不断发展，很多先进的检测技术如酶联免疫检测技术、免疫荧光技术、PCR、实时荧光定量PCR等不断涌现和应用于临床实践。

其中PCR检测技术周期较长，通常需要3-4个小时，必须使用较昂贵的实验条件以及需要较高的专业技术；近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在反应时间还是仪器要求方面，都比PCR技术更有优势。在这些众多等温扩增技术中，又以环介导的等温扩增技术(LAMP)的应用最为成熟、最为广泛，其高灵敏度、高特异性、快速的扩增得到了市场的检验和认可。

发明内容

1．要解决的技术问题

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种蓝氏贾第虫LAMP快速检测方法，它可以对犊牛携带的蓝氏贾第虫进行快速、准确的检测，特异性高、操作简便、成本低，利于监控蓝氏贾第虫病的发生与蔓延，方便及时采取相应措施。

2．技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种蓝氏贾第虫LAMP快速检测方法，包括以下步骤：

步骤一、根据NCBI中已有的蓝氏贾第虫序列，通过序列比对，多次试验的方法，筛选到可以用于蓝氏贾贾第虫LAMP的序列，用软件设计蓝氏贾第虫LAMP引物3组，筛选到最佳引物1组，合成蓝氏贾第虫巢氏PCR引物2对；

步骤二、按照LAMP检测试剂盒扩增反应体系，对反应体系进行优化，通过调整引物、MgCl₂、ThermoPol reaction buffer、dNTP mixture、DNA模板和Bst DNA聚合酶的浓度，确定LAMP反应的最佳反应体系；

步骤三、以蓝氏贾第虫、隐孢子虫、阿米巴原虫、芽囊原虫和弓形虫阳性样品基因组DNA作为模板，以超纯水为阴性对照，加入LAMP反应管中进行特异性试验；

步骤四、向反应管中加入1μL 1000×SYBR Green I，在自然光下用肉眼观察，呈现绿色判定为阳性，保持棕色不变判定为阴性；

步骤五、将蓝氏贾第虫阳性样本的总DNA进行倍比稀释后作为模板，分别用优化后的LAMP反应体系和巢氏PCR进行检测，进行引物敏感性试验；

步骤六、采集新鲜犊牛粪便样本，提取DNA，于-20℃环境下保存备用；

步骤七、分别用优化后的LAMP反应体系和巢氏PCR进行步骤六提取的DNA检测，比较两种方法检测蓝氏贾第虫的阳性率是否具有差异。