[发明专利]基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂及方法

权利要求书

1.一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂，其特征在于:包括聚合酶、四种不同的被标记的核苷酸类似物，四种所述核苷酸类似物的核苷酸3′位置处的羟基均被保护基团或可切割连接基团修饰，且保护基团或可切割连接基团能被切割脱离重新将3′-OH裸露出来，所述可切割连接基团通过共价键或非共价键与环境高敏荧光基团或环境高敏荧光基团标记物链接；四种所述核苷酸类似物分别是化合物1、化合物2、化合物3和化合物4，其中，

化合物1 是不能发岀荧光信号或不带有荧光基团的核苷酸衍生物；

化合物2 是能发出荧光信号的携带有荧光基团的核苷酸衍生物；

化合物3 是携带有环境高敏荧光基团的核苷酸衍生物，在一种条件下不能发岀荧光信号或能发出荧光信号且发出的荧光信号与化合物2发出的荧光信号不同，在另一种条件下能发出荧光信号且发出的荧光信号与化合物2发出的荧光信号相同，所述环境高敏荧光基团的结构与化合物2中的荧光基团的结构不同；

化合物4 是不能发岀荧光信号的但携带有能发生连接反应的可反应性基团的核苷酸衍生物，所述可反应性基团与可反应性荧光基团发生连接反应后能够发岀与化合物1相同的荧光信号；或者化合物4是能够发岀与化合物2相同的荧光信号，但携带有与化合物2不同的可断裂链荧光基团的核苷酸衍生物，所述可断裂链荧光基团能在一定条件下可断裂移除，此条件对化合物2没有影响；

所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4是各自独立地具有式(I)或式(II)或式(III)结构的化合物，

其中，“----”是非共价键；

B代表不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物是指腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)及其类似物；

R1各自独立地选自氢、单磷酸基团、二磷酸基团、三磷酸基团、四磷酸基团或更多个磷酸基团；

R2各自独立地为能够进行正交切割反应的保护性基团；

R3各自独立地选自卤素、-H、-OH、N3或C2-C10柔性链；

L为可切割连接基团或不存在；

R4各自独立地为能够发岀荧光信号的环境高敏荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团、能够进行连接反应的可反应性基团；

R5各自独立地为能够发岀荧光信号的环境高敏荧光基团标记的可反应性基团或能发出相同荧光信号的荧光基团标记的可反应性基团；

所述保护基团是能被聚合酶有效识别,能掺入生长中的DNA链中,并在每一轮SBS测序后能被切割脱离的3’-OH修饰基团；所述可切割连接基团是指链接3’-OH和环境高敏荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团或能够进行连接反应的可反应性基团之间的小分子基团；所述能发出相同荧光信号的荧光基团是在同一激发光源波长下能够发出和选用的环境高敏荧光染料一致或接近的发射波长，并被检测判断为同一荧光信号的非环境高敏荧光染料，所述保护基团是具有如下任意一种结构的基团：

所述可切割连接基团如下任意一种结构的基团：

双硫链基团氰乙基链基团叠氮链基团二烷基缩酮链基团烯丙基链基团1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环已-1-基)乙基链基团硝基苄基链基团偶氮链基团

其中R_1’,R_2’各自独立地选自卤素，-H，C1-C5脂肪链；

所述能发出相同荧光信号的荧光基团来自于如下任意一种或多种荧光染料：AF488、AF532、AF633、AF680、AF660、AF700、AF647、AF 594、AF 555、AF568、CY3、CY5、CY5.5、CY7、CY7.5、ROX、R6G、ATTO 495、ATTO532、ATTO700、ATTO680、ATTO655、ATTO647N、ATTO594、ATTORho101、ATTO 590、ATTO Thio12、FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CAL Fluor Orange 560、TAMRA、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Fluor Red635、iFluor 488、iFluor 514、iFluor532、iFluor 546、iFluor 555、iFluor 568、iFluor 590、iFluor610、iFluor 633、iFluor647、iFluor 680、iFluor700、iFluor710、Quasar705、Quasar670；

所述环境高敏荧光基团选自环境高敏荧光染料，所述环境高敏荧光染料是pH值敏感荧光染料，所述pH值敏感荧光染料是包括如下任意一种结构式的化合物，

其中：X各自独立地选自卤素、-H、-OH、N3、NH2、S、Si或C2-C10柔性链；

R6各自独立地选自氢、聚乙二醇羧基、聚乙二醇链炔基、聚乙二醇叠氮、聚乙二醇链氨基、聚乙二醇马来酰亚胺、聚乙二醇巯基、C1-C10饱和烷基、饱和烷基链炔基、C1-C10饱和烷基链羧基、C1-C10烷基链叠氮基、C1-C10C1-C10烷基链氨基、C1-C10烷基链巯基、C1-C10烷基链磺酸基、C1-C10烷基链马来酰亚胺；

R7各自独立地选自氢、C1-C6饱和烷基；

环A和环B各自独立地选自具有式(Ⅵ)，(Ⅶ)，(Ⅷ)，(Ⅸ)的杂环基团，

其中；Y各自独立地选自氢、氧、碳、氮、硫；

R8，R9和R12各自独立地选自氢、聚乙二醇羧基、聚乙二醇链炔基、聚乙二醇叠氮、聚乙二醇链氨基、聚乙二醇马来酰亚胺、聚乙二醇巯基、C1-C10饱和烷基、饱和烷基链炔基、C1-C10饱和烷基链羧基、C1-C10烷基链叠氮基、C1-C10C1-C10烷基链氨基、C1-C10烷基链巯基、C1-C10烷基链磺酸基、C1-C10烷基链马来酰亚胺；

R10和R11各自独立地选自氢、羧基、磷酸基、磺酸基；

所述可反应性基团是能被聚合酶识别的、且能掺入生长中的DNA链中与相对应的互补基团通过共价键或非共价键进行正交连接反应稳定拼接结构的、并在每一轮SBS测序后能被切割脱离重新产生3’-0H的基团；所述可反应性荧光基团是携带环境高敏荧光基团或能发出相同荧光信号的荧光基团，并与所述可反应性基团通过共价键或非共价键生产进行正交连接反应稳定拼接结构的基团，所述可反应性基团是如下结构中的任意一种，

氨基环炔基叠氮基团马来酰亚胺生物素苯基硼酸地高辛；苯酚环烯基

所述互补基团是是如下结构中的任意一种：

四氟苯基酯环炔基链霉亲和素、4-苯基脲唑叠氮基团水杨基异羟脂酸基、地高辛抗体、巯基四嗪基。