[发明专利]基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂及方法

说明书

本发明涉及一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂及方法，包括聚合酶、四种不同的被标记的核苷酸类似物，四种核苷酸类似物的核苷酸3′位置处的羟基均被保护基团或可切割连接基团修饰，且保护基团或可切割连接基团能被切割脱离重新将3′‑OH裸露出来，可切割连接基团通过共价键或非共价键与环境高敏荧光基团或环境高敏荧光基团标记物链接；四种核苷酸类似物是能发出或不能发出荧光的核苷酸衍生物，并同时公开了利用该试剂进行基因测序的方法。该发明可以有效的识别并催化3′‑O处有大分子基团修饰时进行聚合反应并进行SBS测序，消除以往二代SBS测序方法中由碱基上残基积累而导致影响测序读长的问题。

技术领域

本发明涉及基因测序领域，尤其是一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂及方法。

背景技术

测序技术是用于确定核酸、蛋白质、多糖等生物大分子的一级结构，是生命科学研究的基本工具和获取生物信息数据主要手段，尤其是DNA测序技术，即获得目的DNA片段碱基排列顺序的技术，获得目的DNA片段的序列是进一步进行分子生物学研究和基因改造的基础，使研究人员能够研究并更好地了解健康和疾病，是个性化精准医学范式的必备技术。根据原理的不同，测序技术的发展大致可划分为第一代测序、第二代测序、第三代测序、第四代测序4个历史阶段。由于四代测序技术各有优缺点，应用的领域也不尽相同，因此第一代测序技术仍未被淘汰，目前的测序市场是四代测序技术并存的局面。其中应用最广、发展速度最快的是第二代测序，又称高通量测序，区别于传统的一代测序而言，具有速度快、通量高、成本低的特点。二代测序技术采用克隆扩增和边合成边测序(SBS)的测序化学技术，实现了快速、准确的测序。该过程可在将修饰过带有识别信号基团的脱氧核苷三磷酸(dNTPs)衍生物整合到核酸链的同时对其进行识别。通常的，每个修饰dNTP的碱基带有可切割链连接的荧光标记，并在3’-OH端加以可切割的保护基团(如叠氮，乙烯基，双硫键基团等，US20010972364；US20130079232A1；US20160040225A1；Ju.J.et al.PNAS，2006,103,19635-19640)，这种碱基衍生物也就荧光标记可逆终止子核苷酸(NRT)，不同的NRT会发出独特的荧光信号，该信号可用于确定DNA序列的顺序。有研究表明(Chen.F.et al.GPB,2013,34–40；Stupi.B.P.et al.Angew Chem Int Ed Engl,2012,51,1724-1727；Ondrus.M.et al.NAR.2020,11982–11993)二代SBS测序方法中影响读长的一个重要原因在于迄今为止开发的可逆终止子核苷酸类似物在切割携带荧光团后，无法将荧光基团和碱基之间的链接基团完全去掉，都会在碱基处残留约一定长度的小分子基团(如乙二醇修饰的炔丙基氨基部分)，并随着每一轮的SBS不断的在新形成的DNA双链上累积，到一定程度后，这些残基可能足以干扰DNA双螺旋结构的稳定性和二级结构,从而影响DNA聚合酶对其的识别进而终止链增长反应，限制测序读段长度。为此，有研究者设计了单修饰可逆终止子(MRT)，即把可逆阻断保护基团和荧光基团同时修饰3'-0H基团上,该修饰可以起到双重作用,既为荧光信号的报道子又作为可逆终止子,该修饰方式理论上可以成功的避免采用NRT测序时在碱基上留下的残基,从而降低对DNA双链稳定性以及聚合酶识别等影响,以提高测序的读长。这种方法的主要挑战是,由于在由聚合酶与互补核苷酸和DNA模板形成的复合物状态下,核苷酸的3’-OH位置非常靠近DNA聚合酶的活性位点处的氨基酸残基,因此DNA聚合酶难以接受3’-0大分子染料修饰的核苷酸作为底物。

发明内容

针对现有的不足，本发明提供一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂及方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于环境敏感染料的单色荧光MRT基因测序试剂及方法，包括聚合酶、四种不同的被标记的核苷酸类似物，四种所述核苷酸类似物的核苷酸3′位置处的羟基均被保护基团或可切割连接基团修饰，且保护基团或可切割连接基团能被切割脱离重新将3′-OH裸露出来，所述可切割连接基团通过共价键或非共价键与环境高敏荧光基团或环境高敏荧光基团标记物链接；四种所述核苷酸类似物分别是化合物1、化合物2、化合物3和化合物4，其中，