[发明专利]用于纳米孔测序的Direct RNA混Barcode文库构建方法

权利要求书

1.用于纳米孔直接RNA测序的逆转录接头，其特征在于，由SEQ ID NO:1和2所示的两条单链RNA引物退火而成。

2.根据权利要求1所述的逆转录接头，其特征在于，两条单链RNA引物的5'端经磷酸化修饰。

3.含有权利要求1或2所述逆转录接头的试剂盒。

4.用于纳米孔测序的Direct RNA混Barcode文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)合成权利要求1所述的逆转录接头；

2)样品总RNA的提取以及mRNA的制备；

3)将mRNA与逆转录接头连接后进行反转录合成cDNA；

4)将步骤3)所得的反转录产物连接RNA直测接头后，作为直接RNA测序文库，进行纳米孔测序；

其中，步骤4)中所述的RNA直测接头的序列如下：

Top：5'-TGATGATGAGGGATAGACGATGGTTGTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCTTTTTTTTTTTTTATGATGCAAGATACGCAC-3'

Bottom：5'-GAGGCGAGCGGTCAATTTGCAATATCAGCACCAACAGAAACAACCATCGTCTATCCCTCATCATCAGAACCTACTA-3'。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中将两条单链RNA按等摩尔比混合后，于90-95℃保温2min，然后以0.1-1℃/s的速度梯度退火至20-30℃。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中连接的反应体系如下：mRNA 16.5μl，连接反应缓冲液4.8μl，40U/ml RNase抑制剂0.5-1μl，1.4μM逆转录接头0.5-1μl，400U/μl T4 DNA连接酶1-2μl，总体系24μl；

反应条件为：室温反应25-35min，得到连接产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)中反转录的反应体系为：连接产物24μl，10mM dNTPs 2.0μl，5×第一链缓冲液8.0μl，0.1M DTT 4.0μl，反转录酶2μl；

反应条件为：50℃60min，70℃10min，4℃保存，得到反转录产物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤4)中连接的反应体系如下：反转录产物24.3μl，连接反应缓冲液4.8μl，1.4μM RNA直测接头4.2μl，40U/ml RNase抑制剂0.5-1μl，400U/μl T4 DNA连接酶1-3.0μl，总体系40μl；

反应条件为：室温反应30min，得到连接产物。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤3)～4)之间还包括对反转录产物进行磁珠纯化的步骤；

步骤4)中进行纳米孔测序之前还包括对连接产物进行磁珠纯化的步骤。