[发明专利]用于纳米孔测序的Direct RNA混Barcode文库构建方法

说明书

本发明提供一种用于纳米孔测序的Direct RNA混Barcode文库构建方法，包括：合成独特的RNA Barcode RTA接头，连接接头后将mRNA反转录为cDNA，混样后连接ONT测序接头。该方法可以实现多样本混池Direct RNA测序，直接对原始RNA分子进行测序，可以克服RT和PCR bias。Direct RNA‑seq还可以产生较长的reads，通常覆盖转录本的全长。该方法可以准确地量化转录本，以动态范围分析差异基因表达，同时可以准确鉴定转录本的结构和边界，包括剪接产物，最重要的是可以以单碱基分辨率鉴定RNA修饰的类型。

技术领域

本发明涉及分子生物学和三代RNA测序技术领域，具体地说，涉及一种用于纳米孔测序的Direct RNA混Barcode文库构建方法。

背景技术

超过90％的人类基因存在可变剪接，它们会形成两个或更多的表达异构体。在短读长cDNA测序中有很大比例的读长定位模糊，这种局限在正确识别和定量基因的多种异构体表达上尤为明显。长读长cDNA测序方法能够产生跨越整个异构体的全长转录本序列，从而去除或大幅度减少模糊定位，并改进差异异构表达的分析结果。然而，以上方法依赖于cDNA的合成及PCR扩增，去除了天然RNA的碱基修饰信息，并且只能粗略地估计多聚腺苷酸poly(A)尾长。

N6-甲基腺苷(m6A)是信使RNA和环状RNA中的一种普遍修饰，在调节RNA代谢的各个方面起着重要作用。一种广泛使用的鉴定m6A修饰的方法依赖于m6A特异性抗体，然后进行沉淀RNA测序(MeRIP-Seq)。然而，MeRIP-Seq的一个局限性在于它无法以单核苷酸分辨率提供m6A的精确位置。

ONT直接RNA测序技术是对天然RNA进行测序，能够保留并检测RNA碱基修饰信息，对poly(A)尾长进行相对准确的估算，同时进行全长异构体分析，还原真实RNA特征。通过使用ONT平台直接对native RNA分子进行测序，还可以克服RT和PCR bias。Direct RNA-seq可以产生较长的reads，通常覆盖转录本的全长。该方法可以准确地量化转录本，以动态范围分析差异基因表达，同时可以准确鉴定转录本的结构和边界，包括剪接产物。最重要的是可以以单碱基分辨率鉴定RNA修饰的类型。

目前ONT官方(Oxford Nanopore Technologies)提供的Direct RNA-seq试剂盒，只能满足单一样本的上机要求，高成本严重影响了该技术的适用性。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于纳米孔测序的Direct RNA混Barcode文库构建方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供用于纳米孔直接RNA测序的逆转录接头(RNA Barcode RTA接头)，由SEQ ID NO:1和2所示的两条单链RNA引物退火而成。

优选地，两条单链RNA引物的5'端经磷酸化修饰，即两条单链RNA引物的5'端修饰有PHO。

本发明的逆转录接头适用于所有带A尾的RNA的逆转录。

第二方面，本发明提供含有所述逆转录接头或所述单链RNA引物的试剂盒。

第三方面，本发明提供一种用于纳米孔测序的Direct RNA混Barcode文库构建方法，包括以下步骤：

1)合成所述逆转录接头；

2)样品总RNA的提取以及mRNA的制备；

3)将mRNA与逆转录接头连接后进行反转录合成cDNA；

4)将步骤3)所得的反转录产物(RNA-DNA杂合双链)连接RNA直测接头后，作为直接RNA测序文库，进行纳米孔测序(Direct RNA测序)。

步骤4)中所述的RNA直测接头的序列如下：