[发明专利]一种基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的检测试剂、试剂盒和方法

说明书

本发明提供了一种基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的检测试剂、试剂盒和方法，主要是对突变型等位基因CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17进行鉴定。该检测试剂包括Tris盐、MgCl₂、KCl、海藻糖、Tween20、Triton100、DTT和BSA；该检测试剂的pH值为8.9‑9.2。本发明提供了匹配硅基微流片的taqman荧光定量PCR检测试剂，以较高浓度的Tris和较高pH值及较高浓度的Mg²⁺为特点；且反应体系中酶浓度相对较高，每个反应体系较现有反应体系更小，更加节省试剂，降低试剂成本。基于该检测试剂和反应体系，本发明提供的检测检测时间可以在20‑30分钟范围内，大幅地提高了CYP2C19的检测效率，检测耗时为现有CYP2C19认证试剂盒检测耗时的30‑50％，且检测成本较现有普通的CYP2C19基因分型检测无显著增加。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于硅基微流片的CYP2C19基因分型的检测试剂、试剂盒和方法。

背景技术

CYP2C19参与氯吡格雷、S-美芬妥英、奥美拉唑、伏立康唑、安定、去甲安定等药物的代谢。CYP2C19遗传变异可导致酶活性的个体差异，使人群出现超快代谢者(ultrarapidmetabolizer，UM)、快代谢者(extensive metabolizer，EM)、中间代谢者(intermediatemetabolizer，IM)和慢代谢者(poor metabolizer，PM)4种表型。CYP2C19*2(rs4244285，c.681G＞A)和CYP2C19*3(rs4986893，c.636G＞A)是中国人群中存在的2种导致CYP2C19酶缺陷的主要等位基因，其中，CYP2C19*2导致剪接缺失，CYP2C19*3为终止密码子突变。EM个体只携带CYP2C19*1等位基因，IM个体携带CYP2C19*2或CYP2C19*3杂合子基因型；PM个体包括CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3和CYP2C19*3/*3基因型。东方人群中75～85％的PM由CYP2C19*2所致，约20～25％的PM由CYP2C19*3所致。CYP2C19*17是CYP2C19超快代谢类型的主要基因型(rs12248560)，CYP2C19的超快代谢类型可能导致氯吡格雷使用者出血风险增加。上述通过CYP2C19代谢的药物随患者基因型不同，其疗效和副作用也有明显不同。因此根据检测CYP2C19基因型的多态性来选择用药策略有重要的临床意义。

目前市场上市的CYP2C19基因分型检测试剂盒，主要基于荧光探针法在荧光定量PCR仪上进行基因分型，检测试剂主要含3个SNP位点的qPCR反应混合液和相应DNA聚合酶液，通常检测时间约在50-70分钟之间，未发现已经上市的显著更加快速的CYP2C19基因分型检测试剂盒。

CYP2C19基因分型检测试剂盒目前主要使用目前常见的qPCR反应采用荧光法进行检测，耗材主要使用目前的96孔板或8连管的方式进行检测。其芯片主要为PMMA、PDMA或聚乙烯材质，主要优势是材质成本较低，但是这些芯片在qPCR反应过程中的升降温速度较慢，是限制检测效率的主要问题之一，qPCR检测的耗时通常比较长。选用廉价方便加工的材质是提高PCR检测效率的重要措施之一。硅基材料升降温速度非常快，单晶硅基材料导热系数可以达到149W/mK，远远高于有机材料的导热系数，其材质决定了使用硅基材料作为qPCR反应容器，升降温速度可以达到15-20摄氏度/秒，结合快速的反应试剂，可以极大的提高qPCR的检测效率，通常的检测可以在20-30min中完成。

基于硅基微流片方式的qPCR试剂目前很少，硅基微流片反应腔体为固定体积的小型体系，在其中进行qPCR反应，具有小型体系反应的特点，常见的反应试剂并不匹配该小型反应体系。小型体系检测容易受到样本质量的影响，通常需要较高强度的缓冲体系及较高浓度的DNA聚合酶，保持小型体系的检测效率；所以反应效率较低的PCR试剂可能无法适配硅基微流片中反应的需求。通常现有的qPCR反应试剂无法很好的匹配硅基微流片中的小型体系的检测。

发明内容