[发明专利]重组蛋白结构域及其编码DNA、增强TET酶及全基因组DNA甲基化检测方法

说明书

本发明提供了增强TET酶活性的重组蛋白结构域，为DNA甲基化结合结构域（MBD），MBD1‑4的氨基酸序列如SEQ ID 1‑4所示。通过MBD与TET酶融合形成的重组蛋白MBD‑TET可以显著增强TET酶包括NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD和hTET2CDT对5mC的氧化活性。此外，本发明还提供了简便快速的高通量DNA甲基化检测流程，提高基于TET酶氧化反应的DNA甲基化检测技术的灵敏度和准确性。

技术领域

本发明专利涉及重组蛋白结构域及其编码DNA、增强TET酶及全基因组DNA甲基化检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

DNA胞嘧啶甲基化（5mC）是DNA中最常见的碱基修饰方式，约占所有胞嘧啶的1%-8%，被称为“第五种碱基”。DNA甲基化与染色质状态和基因转录活跃程度具有明显的相关性，是预测基因表达水平的有效依据。因此，DNA甲基化水平检测是临床疾病诊断的有效手段。现有的DNA甲基化检测技术主要是依赖于反向筛选的重亚硫酸盐转化法，其原理是利用重亚硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶转变成尿嘧啶，再通过PCR扩增转变成胸腺嘧啶。这种方法具有DNA损伤大、背景噪音高和准确性低等缺陷。近年来，酶转化法甲基化检测技术因为具备DNA损伤小、背景噪音低、准确性高和数据质量好等优点而成为DNA甲基化检测领域的重要关注点。

DNA羟甲基化酶TET是真核生物中普遍存在的一种α-酮戊二酸（α-KG）和Fe2+依赖的双加氧酶，在生物进化过程中具有高度的保守性。TET酶是DNA去甲基化过程的关键蛋白，可以将5mC通过三步氧化反应（5mC-5hmC-5fC-5caC）转变成5caC。目前的酶转化法DNA胞嘧啶甲基化检测技术都是依赖于TET酶催化甲基化胞嘧啶的能力，TET蛋白是酶转化法DNA甲基化检测技术的核心蛋白，具有极大的工程改造和应用价值。获得一种高活性的重组TET酶突变体，对于体外DNA甲基化技术的发展和在疾病诊断领域的应用，具有重要的价值。

本发明提供了增强TET酶活性的重组蛋白结构域，为DNA甲基化结合结构域（MBD），MBD1-4的氨基酸序列如SEQ ID 1-4所示。通过MBD与TET酶融合形成的重组蛋白MBD-TET可以显著增强TET酶包括NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD和hTET2CDT的氧化活性。此外，本发明还提供了适用于MBD-TET的反应缓冲液和简便快速的高通量DNA甲基化检测流程，能够有效增强MBD-TET对5mC的氧化活性，提高基于TET酶氧化反应的DNA甲基化检测技术的灵敏度和准确性。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种可增强TET酶活性的重组蛋白结构域。

所述的重组蛋白结构域是DNA甲基化结合结构域（MBD），MBD1-4氨基酸序列如SEQID 1-4所示，其中MBD1效果最优。

以及上述MBD的编码DNA，其核苷酸序列如SEQ ID No.10-13中任一项所示。

本发明的第二个目的是提供一种增强TET酶，为在NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD或hTET2CDT的氨基端通过GGGS连接肽连接上述的重组蛋白结构域MBD1、MBD2、MBD3或MBD4，NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD、的hTET2CDT氨基酸序列分别如SEQ ID 5-9所示，其中NgTET1最优。

本发明的又一目的是提供一种全基因组DNA甲基化检测方法，其特征在于其步骤包括：

（1）采用上述的增强TET酶对模板DNA进行氧化；

（2）还原剂处理，碱中和；

（3）DNA回收；

（4）DNA文库构建。

优选的，步骤（1）中所述的氧化反应时加入TET酶反应缓冲液，该TET酶反应缓冲液可以提高TET酶氧化5mC反应中5caC产物的占比。