[发明专利]一种8a型禽腺病毒毒株、灭活疫苗及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种8a型禽腺病毒毒株，其特征在于，所述毒株命名为DK02株，保藏编号为CCTCCNO:V202170，其中，所述病毒毒株为禽Ⅰ群腺病毒中的E种，血清型为8a型。

2.根据权利要求1所述的毒株制备得到的生物制品疫苗，其特征在于，所述疫苗含悬浮鸡肝癌细胞培养的禽I群腺病毒DK02株灭活抗原，含量为灭活前≥10^8.5TCID₅₀/0.1ml。

3.根据权利要求1所述毒株的制备方法，其特征在于，所述毒株是通过蚀斑克隆纯化得到，具体制备方法包括以下步骤：

（1）选取铺满单层的LMH贴壁细胞，弃掉原培养液，加入含有1％禽腺病毒DK02株病毒液的细胞维持液，置于37℃，5％CO₂培养，当细胞病变达80％以上时，冻融2次，收获病毒液，即为F1代病毒，将F1代病毒在LMH贴壁细胞上传代至F5，进行驯化培养；

（2）将F5代禽腺病毒DK02株病毒液用DMEM进行稀释后接种至生长成致密单层的LMH细胞，吸附1h后，弃掉液体，加铺第一层营养琼脂，所述第一层营养琼脂含有终浓度为1％低熔点琼脂糖和含2％胎牛血清的DMEM，置CO₂培养箱，37℃，5％CO₂条件下倒置培养48h后，待细胞出现病变时加铺第二层营养琼脂，所述第二层营养琼脂含有终浓度为1％低熔点琼脂糖和含2％胎牛血清的1×DMEM，37℃，5％CO₂条件下避光倒置培养；

（3）待蚀斑形成后用滴头吸出，连同琼脂糖一起放入1.0ml的不含血清DMEM中，反复冻融3次，使病毒充分释放，接种新的空白LMH细胞，进行病毒增殖，如此重复克隆三次，随机挑选第四代克隆的五个蚀斑，即F9代病毒进行培养，测定病毒含量，分别挑选病毒含量最高的一株毒，通过LMH细胞继续传代，即可获得纯化后的禽I群腺病毒DK02株病毒液。

4.根据权利要求1所述毒株的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）贴壁LMH细胞制备及病毒接种、收获：选取长势良好的LMH贴壁细胞，弃掉原培养液，加入含有1％禽腺病毒DK02株病毒液的细胞维持液，置于37℃，5％CO₂培养，当细胞病变达80％以上时，冻融2次，收获病毒液，即为适应于贴壁LMH细胞培养的DK02株病毒液；

（2）悬浮LMH细胞制备及病毒接种、收获：将由贴壁LMH细胞扩繁得到的禽腺病毒DK02株基础种毒用DMEM进行适当稀释后接种至悬浮LMH细胞中，于37℃，120rpm振摇培养72~96 h后，冻融2次，收获病毒液，分装注明毒种代次及收获时间。

5.根据权利要求1所述的毒株在制备预防由禽I群8a型腺病毒引起包涵体肝炎的兽用疫苗上的应用。

6.一种I群E种8a型禽腺病毒的灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗的抗原来自权利要求1所述禽腺病毒DK02株。

7.根据权利要求6所述的灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗的制备方法包括如下步骤：

油相制备：

取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备管中混合均匀并加热至75～85℃后，再加5份司本80，至温度达到110～120℃时维持20～40分钟，冷却后完成油相制备；

水相制备：

将所述DK02株接种悬浮LMH细胞，培养72～96 h，收获培养物为病毒液；取灭活的禽腺病毒血清8a型病毒抗原液95份，灭菌的5份吐温80，充分混匀；

乳化：

取2份油相，1份水相，放入乳化罐中搅拌，即得所述灭活疫苗。