[发明专利]检测F8基因1号内含子和22号内含子倒位的试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测F8基因1号内含子和22号内含子倒位的试剂盒，本发明将引物分别配置成Q1、B2两组引物组合，Q1组包含引物P、Q、F1、R1、F2，B2组包含引物P、B、F1、R2、F2。每个试剂盒设置两管扩增体系，扩增完成后，通过对应位置条带有无即可判断是否发生倒位。本发明可以一次性检测F8基因内含子22和内含子1倒位，更快更全面的检测效果，避免内含子1倒位情况的遗漏和额外的检测工作，通过两管结果的综合分析，检测准确性高。本发明重复性好，检测DNA量适用范围大，且对不同PCR仪适用性好。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及检测染色体重排，例如染色体片段缺失、重复、倒位、易位等的方法和试剂盒。本发明还具体涉及了检测F8基因1号内含子和22号内含子倒位的方法和试剂盒。

背景技术

血友病为一组遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，其中最常见的是甲型血友病，约占85％。该病为X连锁的隐性遗传性出血性疾病，由于F8基因突变导致FVIII凝血因子含量不足或质量缺陷，导致FVIII凝血因子参与的内源性凝血途径障碍，导致出血的发生，其中F8基因22号内含子倒位是甲型血友病患者的主要致病因素。目前对甲型血友病患者的诊断一般是22号内含子倒位的检测结合其它点突变的检测，即可对致病原因进行确诊。但是约5％患者是由于1号内含子倒位而致病，需要再进行额外的对1号内含子倒位的检测工作。虽然22号内含子倒位和1号内含子倒位的原理类似，但是目前两者的检测一般是独立进行的。

22号内含子倒位的检测，主要有southern印迹杂交法、LD-PCR、I-PCR、IS-PCR等。1号内含子倒位的检测，通过一般PCR即可检测。

Southern印迹杂交法是22号内含子倒位检测的金标准。待测患者的基因组DNA经Bcl限制性核酸内切酶消化后，琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，碱处理使DNA变性，之后印迹到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，以放射性或非放射性标记的DNA探针与固相支持体上的DNA杂交，根据探针的标记特性用相应方法显示杂交条带。正常基因型与患者基因型表现出不同大小的两条条带。Southern印迹杂交法操作繁琐，整个流程需要8-10天，且对DNA的用量大，存在潜在的放射性污染。

1998年，Liu等人设计长距离PCR(LD-PCR)来检测F8基因22号内含子倒位。设计了4条引物P、Q、A、B在同一个反应管中进行扩增，两个引物P和Q分别位于FVIII基因内int22h-1侧翼序列1212bp和1224bp处，两个引物A和B分别位于int22h2/3侧翼序列162bp和118bp处。正常基因型产物大小为12kb PQ片段和10kb AB片段，患者基因型产物大小是11kb PB+AQ片段和10kb AB片段，女性携带者则产生12kb、11kb和10kb。由于1号内含子倒位比22号内含子倒位要小，所以同样的设计下，扩增产物较小，最大仅为2.2kb，只需要普通PCR即可检测。因此当应用PCR技术对22号内含子倒位和1号内含子倒位进行检测时，需要独立的测试体系，两者总共需要3管反应体系进行检测。此外，22号内含子倒位的扩增产物需要琼脂糖凝胶电泳进行结果判断，而11kb和12kb在琼脂糖凝胶电泳分析时不易区分，需要长达8-10h的电泳时间。

2005年，Rossetti等人设计了反向PCR来检测F8基因22号内含子倒位，首先利用BclI限制性内切酶切割基因组DNA，然后使用连接酶使其连接成环，接着使用三条引物IU、ID、ED进行标准的多重反式PCR反应。对于正常基因型产生487bp的片段，而22号内含子倒位患者扩增559bp的片段，22号内含子倒位携带者扩增487bp和559bp的片段。该方法并未提及对1号内含子倒位检测的应用。此外，由于该方法需要额外的酶切连接步骤，没有LD-PCR方便。