[发明专利]黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂及制备方法

权利要求书

1.一种黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1，干细胞与乳酸菌共培养：

以海藻酸钠溶液、CaCl₂溶液和乳酸菌为原料，制备乳酸菌-海藻酸钠凝胶球；将间充质干细胞与乳酸菌-海藻酸钠凝胶球共培养1-3d，分别收集上清液和共培养所得乳酸菌-海藻酸钠凝胶球；

步骤2，分离外泌体与细胞因子：

步骤1收集的上清液离心去除死细胞，再过滤去除细胞碎片及其它较大粒径的颗粒，最后通过超滤浓缩工艺根据分子量依次分离间充质干细胞分泌的外泌体和细胞因子；

步骤3，制备S层蛋白包被的细胞因子脂质体：

将步骤2分离得到的细胞因子复配药物，所得混合溶液注入搅拌状态下的液体磷脂中，然后进行均质处理，得到细胞因子脂质体溶液；

用柠檬酸钠处理步骤1共培养所得乳酸菌-海藻酸钠凝胶球，释放乳酸菌，扩大培养后收集的乳酸菌经氯化锂处理，收集菌体表面的S层蛋白，制得S层蛋白浓缩液；将S层蛋白浓缩液稀释后与细胞因子脂质体溶液混合均匀，混合液于低温静置，得到S层蛋白包被的细胞因子脂质体；

步骤4，制备外泌体-脂质体冻干粉：

将步骤2所得外泌体和步骤3所得S层蛋白包被的细胞因子脂质体混合均匀，添加冻干保护剂，得冻干粉原液，冷冻干燥后制成冻干粉；

冻干粉原液中，总蛋白浓度0.3-1mg/mL，其中外泌体蛋白质量：脂质体蛋白质量＝1：10-50，所述冻干保护剂占冻干粉原液质量的10％；

步骤5，制备黏膜适用的干粉喷雾剂：

得到的冻干粉中添加黏附材料，混合均匀，制备成干粉剂，装入按压式干粉喷雾瓶，即得用于阴道黏膜给药的干粉喷雾剂；所述黏附材料占干粉剂质量的6-30％。

2.根据权利要求1所述的黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法，其特征在于，配制质量浓度3-5％的海藻酸钠溶液和质量浓度2-4％的CaCl₂溶液，分别灭菌，冷却，将乳酸菌放入已灭菌的海藻酸钠溶液中，混合均匀，接着吸取混合液，均匀滴至CaCl₂溶液中，液滴表面钙化成球，4℃交联4-12h后，用无菌水清洗小球，得到乳酸菌-海藻酸钠凝胶球。

3.根据权利要求2所述的黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞为P3-P6代的脐带间充质干细胞。

4.根据权利要求3所述的黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法，其特征在于，步骤2具体为：

将步骤1收集的上清液于300g、4℃下离心5min去除死细胞，再用0.22μm滤器过滤去除细胞碎片及其它较大粒径的颗粒；所得滤液用截留分子量300K的超滤膜分离外泌体；超滤膜过滤所得滤液用截留分子量3-50kd的超滤膜分离细胞因子。

5.根据权利要求4所述的黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法，其特征在于，步骤3中，细胞因子脂质体溶液的具体制备方法如下：将细胞因子复配药物，所得混合溶液注入搅拌状态下的液体磷脂中，注入速度1-4％V/min，液体磷脂搅拌速度800-1000rpm/min，磷脂最终质量浓度0.05-0.5％，完成后继续搅拌5-10min，然后进行均质处理，得到细胞因子脂质体溶液。

6.根据权利要求4所述的黏膜适用的类无针注射效果的外泌体制剂的制备方法，其特征在于，步骤3中，S层蛋白浓缩液的具体制备方法如下：将所述乳酸菌-海藻酸钠凝胶球用55mmol/L的柠檬酸钠溶液裂解，收集乳酸菌，接种至液体培养基中，无氧环境培养1-3d，将菌液在3000rpm转速下离心15min，收集菌体并用PBS缓冲液清洗；向每1g湿重的菌体沉淀中加入15ml的5M氯化锂溶液，常温振荡30min；15000rpm下离心10min后收集上清，置于透析袋中透析，然后浓缩，得到S层蛋白浓缩液；

将S层蛋白浓缩液配置成0.01-0.1mg/mL的溶液，与等体积细胞因子脂质体溶液混合均匀，使S层蛋白与磷脂的质量比为1：5，混合液于4℃放置24h，得到S层蛋白包被的细胞因子脂质体。