[发明专利]大鼠睾丸间质Leydig细胞的分离方法在审
| 申请号： | 202111218183.0 | 申请日： | 2021-10-18 |
| 公开（公告）号： | CN113969259A | 公开（公告）日： | 2022-01-25 |
| 发明（设计）人： | 陈浩林;赵星仪;季敏鹏;温馨;陈丹 | 申请（专利权）人： | 温州医科大学附属第二医院(温州医科大学附属育英儿童医院) |
| 主分类号： | C12N5/071 | 分类号： | C12N5/071;C12N13/00 |
| 代理公司： | 温州瓯越专利代理有限公司 33211 | 代理人： | 孙豪 |
| 地址： | 325000 浙江省温州市*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 大鼠 睾丸 间质 leydig 细胞 分离 方法 | ||
1.一种大鼠睾丸间质Leydig细胞分离的方法，其特征在于，包括如下步骤：获取大鼠睾丸并制备大鼠睾丸细胞悬浊液；
标记大鼠睾丸间质细胞；
磁珠分选(MACS)方法筛选其中的阳性细胞；
通过磁珠分选方法重复提纯阳性细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，针对大鼠睾丸间质细胞的标记采用催乳素受体(PRLR)抗体标记。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，大鼠睾丸细胞悬浊液的制备过程如下：
将睾丸实质置于培养基中消化；
将消化后的组织悬液室温静置，过滤上清液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
通过过滤后的大鼠睾丸细胞用DMEM/F12培养基洗涤；并将大鼠睾丸细胞重悬浮于冰冷的BDIMagTM(BI)缓冲液中；
和/或，通过磁珠分选方法重复提纯阳性细胞时，每次均将阳性细胞部分用900μL BI缓冲液重悬浮后进行磁珠分选。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，当每次重复提纯阳性细胞均将阳性细胞部分用900μL BI缓冲液重悬浮后进行磁珠分选，每次重悬时孵育至少4分钟。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，大鼠睾丸细胞重悬浮于冰冷的BD IMagTM(BI)缓冲液中时，还将细胞密度调整为2-8x107个细胞/毫升。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，标记大鼠睾丸细胞时，向BD IMagTM(BI)缓冲液中添加小鼠-PRLR一抗(1∶150)在4℃孵育30分钟；然后用BI缓冲液洗涤细胞两次，再用抗小鼠IgG1磁性颗粒(1∶20)标记，4℃孵育30分钟。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，大鼠睾丸细胞悬浊液的制备过程如下：
将睾丸实质置于含1mg/ml胶原酶IV的DMEM/F12培养基(添加0.1％BSA)中消化，34℃水浴摇床缓慢摇动30min(90转/分钟)；
将消化后的组织悬液室温静置1min，上清液经70μm孔尼龙网过滤。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在磁珠分选方法筛选阳性细胞时，还先进行孵育8分钟，之后弃掉含阴性细胞的上清。
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