[发明专利]大鼠睾丸间质Leydig细胞的分离方法

说明书

本发明公开了一种大鼠睾丸间质Leydig细胞分离的方法，包括如下步骤：获取大鼠睾丸并制备大鼠睾丸细胞悬浊液；标记大鼠睾丸细胞；磁珠分选(MACS)方法筛选其中的阳性细胞；通过磁珠分选方法重复提纯阳性细胞。本发明的分离方法操作简单简单、细胞产量高、纯度高、活性高，并且不需要昂贵的设备。

技术领域

本发明涉及生物医药，具体为大鼠睾丸间质Leydig细胞的分离方法。

背景技术

睾丸间质细胞(Leydig cells，LCs)的主要功能是产生睾酮(T)，这是一种男性激素，对生殖功能和男性特征的发育和维持至关重要。LCs的数量或功能缺陷都可能导致复杂的症状，包括身体成分的变化、疲劳加剧、性功能障碍、情绪抑郁、认知功能下降和免疫反应降低。由于LCs在雄性的繁殖和总体福祉中发挥着关键作用，多年来，人们在体内和体外环境中对其进行了深入研究，包括毒理学领域的研究。LCs的体外研究需要在尽可能好的条件下分离和培养细胞，将其他睾丸细胞的干扰降到最小，以便在最优的生理条件下检测细胞功能。多年来，从啮齿动物睾丸中分离LCs的各种方法得到了发展。然而，由于组织细胞的复杂性，获得大量高纯度、高活力的LCs仍然具有挑战性。

最早在50年前，科研人员就开始尝试分离LCs，当时大多数研究使用单步法，即通过Percoll离心法从其他睾丸细胞中分离出LCs。为了改进这种方法分离细胞纯度低的缺点，发展出了两步法，即离心淘析和Percoll梯度离心。这两步法可以得到非常高纯度(约95％)的LCs，但细胞产量相对较低、且费时费力。为了提高回收率，对分离程序进行了修改，包括用单位重力沉淀法取代过滤步骤，以提高LCs的回收率。除了这些经典的基于不同的细胞大小和/或密度的分离方法，最新的一项研究基于LCs群体与其他睾丸内细胞的自发荧光差异，采用流式分选(FACS)技术从小鼠睾丸中分离出了LCs。

虽然这些目前可用的LCs分离方法能够获得高纯度的细胞(约95％)，但它们要么细胞回收率低，要么细胞活性低或耗时，更重要的是，这些方法需要特殊的设备，如淘洗仪器或具有分选能力的流式细胞仪。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种大鼠睾丸间质Leydig细胞分离的方法，操作简单、省时、细胞产量高、纯度高、活性高，并且不需要昂贵的设备。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种大鼠睾丸间质Leydig细胞分离的方法，包括如下步骤：

获取大鼠睾丸并制备大鼠睾丸细胞悬浊液；

标记大鼠睾丸间质细胞；

磁珠分选(MACS)方法筛选其中的阳性细胞；

通过磁珠分选方法重复提纯阳性细胞。

作为优选，针对大鼠睾丸间质细胞的标记采用催乳素受体(PRLR)抗体标记。

作为优选，大鼠睾丸细胞悬浊液的制备过程如下：

将睾丸实质置于培养基中消化；

将消化后的组织悬液室温静置，过滤上清液。

具体的，大鼠睾丸细胞悬浊液的制备过程如下：

将睾丸实质置于含1mg/ml胶原酶IV的DMEM/F12培养基(添加0.1％BSA)中消化，34℃水浴摇床缓慢摇动30min(90转/分钟)；

将消化后的组织悬液室温静置1min，上清液经70μm孔尼龙网过滤。

作为优选，通过过滤后的大鼠睾丸细胞用DMEM/F12培养基洗涤；并将大鼠睾丸细胞重悬于冰冷的BD IMag^TM(BI)缓冲液中；

和/或，通过磁珠分选方法重复提纯阳性细胞时，每次均将阳性细胞部分用900μLBI缓冲液重悬后进行磁珠分选。