[发明专利]生物耗材PCR抑制剂残留的检测方法

权利要求书

1.一种生物耗材PCR抑制剂残留的检测方法，其特征在于包括：

S1、将待检测的生物耗材置入无菌袋中，并加入初始浸润液浸没所述生物耗材，且使所述生物耗材与初始浸润液的质量体积比为1g：10mL，再在37℃放置1-2h，之后取出所述生物耗材，而将余留的浸润液作为待检测试样在室温下静置1-2h，然后均匀地分成m份，m≥3，分别记为溶液A₁、溶液A₂、…溶液A_m，所述初始浸润液采用1×TE 缓冲液；

S2、将溶液A₁均匀地分成n份，n≥3，分别标记为溶液A₁₁、溶液A₁₂、…溶液A_1n；

S3、在溶液A₁₁、溶液A₁₂、…溶液A_1n中分别加入包含SYBR Green试剂的荧光定量PCR试剂，所述荧光定量PCR试剂的试剂盒包含过量的SYBR Green试剂及PCR扩增组件；

S4、进行PCR实验，并在PCR扩增阶段根据实际实验信息确定基线与阈值，其中将基线设置为PCR初始扩增阶段PCR产物的量，并将阈值设置为所述基线的10倍，当扩增反应达到阈值时，分别记录溶液A₁₁、溶液A₁₂、…溶液A_1n中每一个溶液中达到阈值时的Ct值，再排除其中被污染样本的Ct值，并计算剩余样本的Ct值的平均值，由此获得溶液A₁组的Ct值，

其中，若溶液A₁₁、溶液A₁₂、…溶液A_1n中一个溶液达到阈值时的Ct值与所有溶液达到阈值时的Ct值的平均值相差大于0.5，则将该溶液视为所述被污染样本；

S5、根据溶液A₁组的Ct值，选择对溶液A₂进行稀释或浓缩后继续进行检测，其中：

若溶液A₁组的Ct值≤2，则将溶液A₂稀释为溶液A₁的10倍稀释液，溶液A₃稀释为已经过10倍稀释的溶液A₂的10倍稀释液，以此类推；

若溶液A₁组的Ct值≥35，则将溶液A₂浓缩为溶液A₁的10倍浓缩液，溶液A₃浓缩为已经过10倍浓缩的溶液A₂的10倍浓缩液，以此类推；

若2＜溶液A₁组的Ct值＜35，则将溶液A₂浓缩为溶液A₁的2倍浓缩液，溶液A₃浓缩为2倍浓缩后的溶液A₂的2倍浓缩液，以此类推；

并且，当溶液A₁组的Ct值≤2，且已经过10倍稀释的溶液A₂组的Ct值变化为＞2且＜35时，则将溶液A₃浓缩为已经过10倍稀释的溶液A₂的2倍浓缩液，以此类推；而当溶液A₁组的Ct值≥35，且已经过10倍浓缩的溶液A₂组的Ct值变化为＞2且＜35时，则将溶液A₃浓缩为已经过10倍浓缩的溶液A₂的2倍浓缩液，以此类推；

S6、按照步骤S2-步骤S5的操作，对溶液A₂、…溶液A_m的Ct值继续进行检测，直至连续三次测得的溶液A_i组的Ct值均＞10而＜35，i=1、2、3、…m，即获得待检测试样的Ct值，定义为试样组Ct值，同时确定以该溶液A_i组进行PCR实验时所采用的DNA模板浓度；

S7、将初始浸润液在37℃放置1-2h后，再在室温下静置1-2h，然后加入所述荧光定量PCR试剂，并使其中的DNA模板浓度达到与以所述溶液A_i组进行PCR实验时所采用的DNA模板浓度相同的DNA模板浓度，之后按照步骤S4的操作进行PCR实验，由此获得初始浸润液组的Ct值，定义为对照组Ct值；

S8、依据△Ct的数值判定生物耗材中是否有PCR抑制剂残留，其中△Ct =试样组Ct值-对照组Ct值，其中：

若△Ct＞2，则判断待检测生物耗材中有PCR抑制剂残留，

若△Ct≤2，则判断待检测生物耗材中无PCR抑制剂残留；

其中，所述生物耗材为PCR用生物耗材，所述PCR抑制剂选自苯酚、聚丙烯、二甲苯胺中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S4中对溶液A₁₁、溶液A₁₂、…溶液A_1n采用重复性实验检测方法。