[发明专利]生物耗材PCR抑制剂残留的检测方法

说明书

本发明公开了一种生物耗材PCR抑制剂残留的检测方法，其包括：以初始浸润液对待检测耗材进行预处理，获得待检测试样；将待检测试样均匀分为多份，并分别加入PCR试剂盒进行PCR检测，直至获得待检测试样的Ct值，定义为试样组Ct值；将初始浸润液预处理后，也加入PCR试剂盒进行PCR检测，由此获得初始浸润液组的Ct值，定义为对照组Ct值；依据ΔCt的数值判定生物耗材中是否有PCR抑制剂残留，ΔCt＝试样组Ct值‑对照组Ct值。本发明的检测方法综合考量了生物耗材在PCR扩增反应中受到的多种影响，且可以避免人为因素的影响，能够实现对生物耗材中PCR抑制剂残留情况的精准、快速、高通量的检测。

技术领域

本发明具体涉及一种生物耗材PCR抑制剂残留的检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

PCR用生物耗材在生产、包装、运输等过程中容易残留各种抑制PCR反应的各类物质，如苯酚、聚丙烯、二甲苯胺等，从而会对PCR扩增效率等造成不良影响。为避免使用残留有PCR抑制剂的不合格生物耗材所带来的检测准确性差等问题，一般需要预先对PCR用生物耗材中PCR抑制剂的残留情况进行检测。理论上来说，气/液相色谱法、质谱法、光谱法等均可以用于检测生物耗材PCR抑制剂残留，但是其需要较为复杂的预处理过程，且未考虑到PCR反应过程中DNA模板、引物及其它PCR所需组件等与生物耗材的相互作用及人为因素的干扰，因此检测结果往往与实际情况存在较大偏差。本申请人此前也开发过一种检测PCR用生物耗材中PCR抑制剂的方法，其主要是利用荧光定量PCR试剂SYBR GREEN检测预处理过生物耗材的去离子水，再检测荧光量来判定是否存在PCR抑制剂，但此种方法仍无法实现精准检测。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种生物耗材PCR抑制剂残留的检测方法，从而克服现有技术的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种生物耗材PCR抑制剂残留的检测方法，其包括：

S1、将待检测的生物耗材浸入初始浸润液，并在37℃放置1-2h，之后取出所述生物耗材，而将余留的浸润液作为待检测试样在室温下静置1-2h，然后均匀地分成m份，m≥3，分别记为溶液A₁、溶液A₂、…溶液A_m；

S2、将溶液A₁均匀地分成n份，n≥3，分别标记为溶液A₁₁、溶液A₁₂、…溶液A_1n；

S3、在溶液A₁₁、溶液A₁₂、…溶液A_1n中分别加入PCR试剂盒，所述PCR试剂盒包含过量的荧光试剂及PCR扩增组件；

S4、进行PCR实验，并在PCR扩增阶段根据实际实验信息确定基线与阈值，当扩增反应达到阈值时，分别记录溶液A₁₁、溶液A₁₂、…溶液A_1n中每一个溶液中达到阈值时的Ct值，再排除其中被污染样本的Ct值，并计算剩余样本的Ct值的平均值，由此获得溶液A₁组的Ct值；

S5、根据溶液A₁组的Ct值，选择对溶液A₂进行稀释或浓缩后继续进行检测；

S6、按照步骤S2-步骤S5的操作，对溶液A₂、…溶液A_m的Ct值继续进行检测，直至连续三次测得的溶液Ai组的Ct值均＞10而＜35，i＝1、2、3、…m，即获得待检测试样的Ct值，定义为试样组Ct值，同时确定以该溶液Ai组进行PCR实验时所对应的合适DNA模板浓度；