[发明专利]一种检测降纤酶原料及其制剂的活性的方法及应用

说明书

本发明涉及降纤酶原料及其制剂检测技术领域，具体涉及一种利用生色底物法检测降纤酶原料及其制剂的活性的方法及应用。本发明提供的降纤酶活性的检测方法，是通过建立降纤酶标准品水解发色底物的水解产物的吸光度值与降纤酶标准品的活力值的标准曲线方程以实现对降纤酶样品活性的检测；所述的降纤酶样品包括降纤酶原料或其制剂。本发明所述的降纤酶活性的检测方法在保持较高准确性、精密度的同时还具有更简便、高效的优点，且对试验仪器要求低，具有普适性，更具有实用价值。此外，本发明所述的检测方法不受辅料影响，既适用于降纤酶原料及其制剂的活性检测，还可用于降纤酶制剂处方的筛选。

技术领域

本发明涉及降纤酶原料及其制剂检测技术领域，具体涉及一种利用生色 底物法检测降纤酶原料及其制剂的活性的方法及应用。

背景技术

蛇毒中含有丰富的蛋白质，其中半数以上是具有催化活性的酶类，其作 用分为神经毒类和出血毒类。类凝血酶就是出血毒性的一种，是目前研究最 多并在临床上应用最为成熟的蛇毒类生化药品。

而降纤酶即为蛇毒类凝血酶的一种，具有去纤、降粘、解聚、溶栓等抗 凝作用，广泛用作临床治疗和预防心脑血管性疾病。

关于降纤酶原料及制剂的效价和含量测定，现有研究提供了多种方法。

具体如下：

传统方法采用的是纤维蛋白凝固法，通过测定降纤酶在体外将纤维蛋白 原转变为纤维蛋白后生成凝块的时间来判定降纤酶的效价。该方法不但受主 观影响大，还受降纤酶辅料右旋糖苷的影响，影响降纤酶制剂的检测准确性。

胡良才等报道了精氨酸酯酶活性法，通过紫外法测定精氨酸酯酶裂解对 甲基本磺酰胺-L-精氨酸甲酯(TAME)产生的裂解产物的吸收值来检测降纤 酶的活性。该方法经改进后用HPLC测定TAME的减少量或其产物的量求得降 纤酶的活性。然而该方法选择性不好，并且TAME不稳定，产生的误差大。

国内学者还采用酶联免疫吸附法(ELISA)技术用于降纤酶制剂及血浆中 微量降纤酶含量的测定，然而该方法需要偶联抗原抗体，成本较高，很难广 泛应用。

雷丹青等报道了发色底物法，原理是降纤酶与发色肽S-2160 (Bz-Phe-Val-Arg-PNA)释放出有强吸收峰的对硝基苯胺(PNA)，通过比色 法计算含量。然而该发色肽S-2160成本高，还没有商业化应用。

徐梅、李娜等公开了一种测定类凝血酶活性的方法，其同样采用发色底 物法，并根据酶动力学测试方法，以商业化发色肽S2238为底物，利用紫外分 光光度计进行测试，通过建立活力U与吸光度变化值、反应体积、反应时间的 关系曲线，进而根据曲线计算酶活力。但由于反应速率对温度过于敏感，须 严格控制反应温度，因此该方法对检测仪器要求非常高，须采用可控温紫外 分光光度计，普通实验室难以推广使用；而且该方法需要对整个反应过程实 时监控，每30s测试一次吸光度，需要多次计时，增加操作人员的工作量的同时也增加人工误差概率。此外，该方法仅公开了类凝血酶原料活性的检测而 没有对其制剂的质量控制进行具体研究。

鉴于上述方法的局限性，寻找一种高效、准确、具有普适性并可用于降 纤酶制剂的质量控制的降纤酶活性测定方法成为降纤酶应用研究的关键所在。

发明内容

本发明提供一种新的降纤酶原料及其制剂的活性的方法。该方法高效、 准确、普适性好，适用于大多数普通实验室检测，而且可用于降纤酶原料及 其制剂的质量控制，解决了现有降纤酶原料及其制剂活力检测存在的问题。

本发明提供的降纤酶活性的检测方法，是通过建立降纤酶标准品水解发 色底物的水解产物的吸光度值与降纤酶标准品的活力值的标准曲线方程以实 现对降纤酶样品活性的检测；所述的降纤酶样品包括降纤酶原料或其制剂。